生信如何巧妙利用circRNA发3分+
小编今天解读的这篇文章是2020年发表在Annals of Translational Medicine杂志（IF：3.297），题目为Identification and integrated analysis of hepatocellular carcinomarelated circular RNA signature。本研究识别出肝细胞癌相关环状RNA，进而揭示了circHMGCS1 / miR-581 / AURKA，circHMGCS1 / miR-892a / KIF5B和circTMCO3 / miR-577 / RHOA调控轴可作为检测HCC的新型生物标志物。上述circRNA的相互作用对可能参与了肝癌的发生和发展。
摘要
背景：环状RNA（circRNA）是一种新型的非编码RNA，在癌症的发病机理和发展中起着至关重要的作用。 CircRNA标记可用作预后和预测因素，以及作为评估疾病状态和预后的临床工具。 本研究以探索肝细胞癌（HCC）中新的circRNA标记为目的。
方法：CircRNA表达谱从GEO中得到。 miRNA和mRNA的表达谱从TCGA和GTEx数据库获得。 通过qPCR验证了微阵列的结果。基于circRNA-miRNA对和miRNA-mRNA对，构建了ceRNA网络。 又执行了功能分析GO，KEGG，GSEA和GSVA。 此外，使用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验进行生存分析。
结果：使用生物信息学方法筛选并分析了GEO数据库（GSE94508和GSE97332）的HCC中差异表达的circRNA。 通过qPCR检测到总共26个差异表达的circRNA，然后选择了6个circRNA来构建circRNA-miRNA-mRNA网络。 通过预后分析，发现了circRNA的3个靶中心基因（AURKA，KIF5B和RHOA）。 此外，GSEA和GSVA被用来揭示AURKA，KIF5B和RHOA在肝癌中的功能。
结论：作者识别了三个hub基因，结果表明circHMGCS1 / miR-581 / AURKA，circHMGCS1 / miR-892a / KIF5B和circTMCO3 / miR-577 / RHOA轴可能在肝癌进展中起着至关重要的作用。
流程图
结果简述
1. 识别差异表达circRNA和miRNA
从GEO数据库下载两个circRNA芯片数据集（GSE94508和GSE97332），并使用limma R识别DEcircRNA。在GSE94508数据集中共识别了270个DEcircRNA（25个上调和245个下调）（下图A，B）。在GSE97332数据集中，共识别出869个DEcircRNA（421个上调和448个下调）（下图C，D）。
作者从两个数据集中获得了26个重叠的DEcircRNA，并对其进行了进一步验证。使用qPCR检测这些DEcircRNA在SMMC-7721细胞中的表达。其中，验证了六个DEcircRNA的mRNA表达丰度在SMMC-7721细胞中上调（如下图）。
此外，下表列出了这6个DEcircRNA的基本特征。它们的基本结构模式如下图所示。
基于TCGA-LIHC，使用edgeR软件包分析获得了251个差异表达的miRNA（DEmiRNA，229个上调和22个下调）。
2. ceRNA网络的构建和功能分析
为了更好地理解circRNA在miRNA介导的mRNA中的作用，作者构建了circRNA-miRNA mRNA（ceRNA）网络。首先，使用CircInteractome数据库，预测了6个DEcircRNA靶向的miRNA，并识别了100个circRNA-miRNA对。与DemiRNA相交后，仅保留了13个circRNA-miRNA对，包括6个circRNA和11个DEmiRNA。然后，在3个数据库（miRDB，miRTarBase和TargetScan）中确定了11个DEmiRNA靶向的mRNA。最后，基于HCC中的6个circRNA节点，11个miRNA节点和114个mRNA节点建立了一个ceRNA网络（见下图）。
为了更好地理解ceRNA网络中与circRNA相关靶基因相关的功能富集分析和通路。如下图5所示。此外，GSVA进一步证实，高水平的circRNAs相关靶基因显著富集在细胞毒性，碱基切除修复和细胞周期中。
3. CircRNA-miRNA-hub基因网络的构建及hub基因的功能富集分析
基于| log2FC | > 1且FDR <0.05时，作者从TCGA-LIHC和GTEx数据库中总共获得了2135个差异表达的mRNA（DEG）。以上结果表明7个DEG参与了ceRNA网络。然后，为了进一步探讨这些hub基因在癌变和肝癌发展中的功能，作者还建立了CircRNA-miRNA-hub基因调控网络。首先，使用venn图分析（下图A）展示了TCGA和GTEx中的106个circRNA相关靶基因和2135个DEG，并生成了7个常见靶基因DEG（CITED2，ACSL4，MARKS，KIF5B，AURKA，SMO和RHOA）。然后，使用Cytoscape构建circRNA-miRNA-hub基因网络（下图B）。此外，使用GEPIA数据库绘制的Kaplan-Meier曲线表明，AURKA，KIF5B和RHOA的较高表达与较差的总体存活率显著相关（下图C，D，E），但是，没有 CITED2，ACSL4，MARCKS或SMO显示出显著的预后意义。进一步使用EdgeR软件在TCGA和GTEx数据中验证了7个hub基因的表达水平，发现与正常组织相比，肿瘤组织中的AURKA，KIF5B和RHOA上调，如下图F所示。
为了进一步研究AURKA，KIF5B和RHOA在肝癌中的潜在作用，进行了GSEA和GSVA的分析。GSEA的结果表明，富集得分最高的hub基因与癌症相关的信号通路密切相关（下图A，B，C）。此外，GSVA证实，高表达AURKA，KIF5B和RHOA的组中富集了许多与细胞周期相关的KEGG通路，包括DNA复制和错配修复，进一步表明这些标志性基因的激活可能参与了肿瘤增殖过程。（下图D，E，F）。
本研究揭示了circHMGCS1 / miR-581 / AURKA，circHMGCS1 / miR-892a / KIF5B和circTMCO3 / miR-577 / RHOA调控轴，可作为检测HCC的新型生物标志物。最后，生物信息学分析表明，上述circRNA的相互作用对可能参与了肝癌的发生和发展。