晚期卵巢癌的肿瘤免疫异质性揭示了化疗的免疫原性作用

Unraveling tumor–immune heterogeneity in advanced ovarian cancer uncovers immunogenic effect of chemotherapy

Nature Genetics（IF：25.455），2020.06

导语

GUIDE ╲

背景介绍

典型的HGSOC表现为多处腹膜肿瘤，在NACT术后均采用预先手术减瘤或延迟原发手术治疗。因此，HGSOC是研究同一患者多个部位TME特征并量化治疗扰动后的变化的理想疾病。在HGSOC中，相对低的体细胞点突变负荷、高的非整倍体水平和高水平的拷贝数改变（CNAs）与低免疫原性（是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、 增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性）相关。研究表明，T细胞浸润（CD3+CD8+）在原发环境中预测HGSOC的生存期中起着重要作用。最近的研究已经开始定义突变瘤内异质性和T细胞互作之间的相互作用，以及化疗对HGSOC中T细胞浸润的潜在影响。然而，TME异质性的程度、其潜在机制及其对治疗反应的影响仍不清楚。为了解决这些问题，本工作对来自两个不同患者组群的HGSOC样本进行了系统的免疫基因组学分析。

数据介绍

1.未治疗样本群：10个HGSOC患者的49份样本。有组织样本都是基于成像环境获得的。从临床资料中获得种系BRCA1和BRCA2突变状态数据。

2.NACT（新辅助化疗）群：40名患者的80份配对样本。患者都接受了基于铂和紫杉的治疗方案。在40个配对样本中，有17个样本是位点匹配的，23个样本是位点不匹配的。分别生成28对和37对基因表达和TCR测序数据。TCR序列非常低的样本（n=5个样本;10对）未纳入下游分析，因为TCR克隆性置信度低。

结果解析

01

患者内转录组异质性主要由免疫相关特征基因解释

为了调查在未治疗的HGSOC中的TME，分析了38个原发和转移瘤样本的转录组，这些样本来自收集的10个患者中的8个（图1a，b）。为了提供准确的采样，切除了卵巢肿瘤团块和腹膜转移灶，并将其放置在根据高分辨率T2-weighted核磁共振（MR）图像中的肿瘤分割数据设计的lesion-specific三维模型上。首先对整个转录组进行聚类分析，以及独立分析编码蛋白的转录组。肿瘤样本的整体基因表达具有高度的患者特异性，而不考虑解剖位置或肿瘤细胞结构（肿瘤细胞在样本细胞混合物中的比例），使用t-distributed stochastic neighbor embedding （t-SNE，是一种非常流行的非线性降维技术，主要用来对高维数据进行可视化，了解和验证数据或者模型）或层次聚类（图1c）。为了关注明确定义的生物学过程和信号通路，使用50个标志性基因集进行了单样本基因集富集分析（ssGSEA），以及基质和免疫特征基因和基于大块肿瘤mRNA使用ESTIMATE方法确定的肿瘤细胞特征。将MSigDB hallmark基因集分为5类：致癌、细胞应激、免疫、基质和其他。主成分分析（PCA）表明，大多数样本之间的基因集富集差异可以用致癌基因集、免疫基因集和基质基因集来解释（图1 d）。与全转录组分析相比，患者特异性聚类不那么明显，说明不同患者的肿瘤具有共同的通路激活模式和非癌细胞相关基因集。为了调查哪些基因集可以解释观察到的变异，计算了主成分特征载荷，分析表明， PC1可以用肿瘤细胞特性（变异47%）来解释，因为免疫和基质基因集vectors 与致癌vectors 的方向相反，而PC2似乎可以区分免疫和基质基因集，但没有发现统计学意义（图1e）。无监督的层次聚类分析证实了样本聚类是肿瘤细胞性的一种功能，并且尽管hallmark类内的基因重叠极小，但仍有单独的致癌和免疫基因集聚类。

由于免疫相关特征基因的差异表达解释了样本之间的大部分差异，接下来通过计算每个样本的ESTIMATE免疫评分，进一步研究了患者内免疫异质性的程度。比较了该团队之前发布的工作的HGSOC样本（case study）和TCGA的307 个未治疗的卵巢癌样本的免疫评分。总体而言，该团队样本的免疫评分在预期范围内（图1f），表明免疫特性在人群水平上具有代表性。部分患者（01、04、10和case study）显示了与TCGA卵巢癌样本人群水平观察到的患者间变异相当的表型内变异，这表明在诊断HGSOC时，在单个个体内，不同的免疫微环境可以共存。

02

不同肿瘤免疫微环境与空间T细胞浸润异质性在HGSOC中共存

为了进一步分析HGSOC的TME特征，在每个样本的至少10个肿瘤切片（不包括基质的区域）中对CD4+、CD8+和调节性T （Treg）细胞（CD4+FOXP3+）进行了多色免疫荧光（IF）染色和定量，从而得到440个影像和量化的肿瘤切片（图2a，b）。多区域和多位点IF分析显示，未治疗的HGSOC患者肿瘤部位的T细胞浸润存在差异，从不足1%（如患者06）到部分部位超过10%（如患者10）。此外，一些患者的肿瘤部位在不同的成像环境下，同一肿瘤部位的T细胞浸润表现出显著差异（患者01）。使用分层随机效应模型（hierarchical random-effect models），发现在CD8+、CD4+和T reg细胞中，T细胞浸润在不同 habitats之间和 habitats内（指相同的肿瘤位点内）的变异性高于不同肿瘤部位和不同患者（图2a），说明T细胞浸润的空间内变异大于不同部位和患者之间的变异。

03

转录分析指出在高肿瘤性的样本中Wnt和Myc通路富集

为了评估T细胞以外的免疫细胞和基质细胞类型的浸润水平，比较了不同的TME细胞去卷积方法和细胞类型特异性特征。使用本工作的HGSOC样本的WES-derived tumor cellularity（TITAN）（WES即whole-exome sequencing全基因组测序）和T细胞计数，以及TCGA HGSOC样本的WES-derived tumor cellularity （ABSOLUTE）和白细胞甲基化评分，对7种不同的方法和ConsensusTME进行了基准测试。ConsensusTME在不同基准测试中排列前三（图3a，b）。将ConsensusTME用于未治疗的样本的转录数据，以探索除CD8+、CD4+和Treg细胞外的细胞类型是否在样本中具有明显的浸润模式。首先使用细胞的估计的ConsensusTME基因集的NES来可视化样本间的差异，并证实了细胞内TME异质性，肿瘤的不同细胞类型显示出浸润的不同高低水平（图 3c）。正如预期的，PC1通过肿瘤细胞结构将样本分开，解释了74%的方差。在分析接下来的主成分（PC2和PC3）时，解释大部分变异的细胞类型是细胞毒素的、NK细胞和T细胞（与肿瘤细胞相反），成纤维细胞和内皮细胞（与肿瘤细胞方向一致相反）（图3c，d）。

接下来评估特异性基因或转录程序是否与免疫浸润的可变性相关。使用样本中median WES-derived tumor cellularity （TITAN）对高和低肿瘤细胞数的样本进行分类，作为正交肿瘤细胞量化。利用样本-患者依赖性（即考虑到来自同一患者的多个肿瘤样本）进行了差异表达分析，以增加统计效能，并避免出现患者特异性的假偏倚。与预期的一样，在低肿瘤细胞性的样本中，免疫激活相关基因高表达，而在高肿瘤细胞性的样本中，只有4个基因（BAIAP2L1、RCC2、CLDN12和PRKAA2）高表达（图3e）。GO富集分析显示，低肿瘤细胞性的样本中高表达的基因在炎症相关过程中富集，如体液反应、干扰素（IFN）-γ反应和白细胞激活（图3 f）。在高肿瘤细胞性的样本中，未发现高表达基因在 GO显著富集。

为了研究在高肿瘤细胞样本中哪些分子信号通路或TME细胞类型更丰富，使用差异表达分析的T统计量进行了ssGSEA。正如预期，免疫和基质特征在低肿瘤细胞性的样本中高度富集，IFN-γ反应和IFN-α反应也一样。相比之下，Myc和Wnt信号在高肿瘤细胞性的样本中似乎高度富集（图3g）。接下来证实了TCGA卵巢癌样本中免疫和Wnt信号评分的互斥性，发现Myc信号也有同样的趋势。在未治疗的样本中，Myc信号与所有患者的免疫特征呈一致的阴性趋势，并且该特征在高肿瘤细胞的样本中富集。当考虑TME时，只有单核细胞在高肿瘤细胞样本中更普遍（图3 h）。这些观察结果表明，高Myc和Wnt信号可以被认为至少部分独立于肿瘤的增殖，并可能有助于免疫细胞的排斥。

04

整合转录组和突变分析支持Myc和Wnt信号与免疫细胞排斥关联

接下来使用WES来描述这些肿瘤中免疫排斥的突变景观。共对10例未治疗的HGSOC患者的47例肿瘤样本和10例正常样本进行了测序（图1a）。对样本进行单核苷酸变异（SNVs）和小的插入和缺失分析。此外，通过使用TITAN来推断DNA CNAs和肿瘤的倍性、细胞性和亚克隆性。正如预期的，发现在WES拷贝数衍生的细胞性估计（TITAN）和之前使用的ESTIMATE免疫细胞分数之间存在负相关。发现用TITAN计算的WES-derived的肿瘤细胞性与ASCAT呈正相关，与基于IF的T细胞浸润评估负相关。正如预期的，除了KRAS和MYC的频繁扩增之外，10例患者中有9例检测到TP53突变（图4a）。未观察到肿瘤细胞性与HGSOC抑癌基因或癌基因突变之间的关联（图4a），也没有检测（Polysolver）到人类白细胞抗原（HLA）基因的突变，这与先前对primary HGSOC样本的分析一致。

在卵巢癌中，CNAs和染色体不稳定性可由如BRCA1/BRCA2相关的同源重组缺失（HRD）、基因断裂事件和扩增相关的反向折叠等不同的突变过程驱动。为了评估这类过程，量化了之前定义的拷贝数特征，这些特征是由包括断点计数、拷贝数变化和分段大小在内的特征构建的，这能够定量暴露导致卵巢癌基因组不稳定的mutagenic细胞过程。然后，将同样的基于 WES-based的拷贝数特征分析应用于基于TITAN的高可信度纯度和倍性匹配的未治疗样本，发现特征1和4在样本中有高平均暴露（both 30%，图4 b）。特征1反映了致癌Ras-MAP激酶信号、端粒缩短和扩增相关的反向折叠，特征4与致癌PI3K和Myc信号通路及全基因组重复有关。接下来探究特异性拷贝数特征是否与免疫细胞浸润有关。特征4的高暴露样本与低ESTIMATE 免疫评分相关（图4c）。总体而言，Signature4和Signature1表现出相反的趋势，分别与免疫评分呈负相关和正相关。这些数据表明，HGSOC的特异性突变过程可能与不同的肿瘤免疫微环境有关。

为了研究特异性通路相关的SNVs是否与肿瘤细胞相关，进行了突变富集分析，控制了样本突变量和患者依赖性。检测了凋亡、活性氧和基质功能相关突变，Wnt信号通路基因集在高肿瘤细胞性肿瘤中富集（图4 d）。然后，评估了功能性突变富集（非沉默SNVs除以该基因集中的基因总数）是否影响通路基因的表达，发现间质基因集与其NES呈负相关，Wnt信号表达与其NES呈正相关。这些结果表明，高水平的Wnt信号可能是Wnt通路调控因子功能突变的结果，虽然这些是原发性肿瘤中罕见的突变。

为了评估CNAs的肿瘤细胞的基因表达调控，整合了转录组、基因组和肿瘤细胞性数据。简单地说，对于一个给定的基因，有CNAs的基因表达与和肿瘤细胞性的正相关表明该基因主要在癌细胞中表达，而不是在非癌细胞中（如免疫细胞或基质细胞）。计算了这些全基因组相关性，并对属于hallmark基因集的基因排序后的相关性系数进行了GSEA（图4 e）。与预期的一样，免疫和基质基因组的有CNAs基因表达与肿瘤细胞性呈负相关。而Myc靶点的基因表达、CNAs与肿瘤细胞性呈正相关，说明Myc靶点的过表达是由CNAs诱发的肿瘤来源。但MYC转录因子扩增与mRNA表达无显著相关性， MYC mRNA表达与肿瘤细胞性无显著相关性。整合的转录、CNA和IF分析为解释肿瘤基因表达提供了线索，因为Myc靶基因可能在肿瘤发展过程中选择性的扩增和过表达。

05

化疗可诱导免疫细胞浸润

为了研究化疗对TME的影响，并评估上述TME内异质性是否可能是一个潜在的混杂因素，研究了新辅助铂和紫杉烷化疗前后18个部位匹配和38个部位不匹配的肿瘤的转录组（图5 a， b）。通过对整个转录组进行t-SNE降维，发现处理过的和未处理过的样本分别聚集在一起（图5c），与以patient-specific方式聚集的未治疗样本形成对比（图1a）。使用hallmark基因集的ssGSEA NES，观察到处理前和处理后的样本组被前两个主要成分分开（图5d）。仅在位点匹配的样品中，处理前样品的PC1值高于处理后样品（图5d），较高的PC1值与致癌通路正相关，而免疫和基质特征与致癌通路负相关。此外，在位点匹配的样本中，免疫特征NES与Myc信号呈负相关，类似于Wnt信号，证实了之前的观察。同样，在ConsensusTME下，部位匹配的治疗前和治疗后的样本单独聚集（图5e）。

06

TME的异质性掩盖了化疗诱导的免疫激活

为了评估处理前后样本之间的差异，对位点匹配和非位点匹配的样本进行了探索性分析，利用独立的hallmark和ConsensusTME NES进行成对比较（图6a）。位点匹配的样本的治疗后样本中显示免疫相关的标记基因集和ConsensusTME评估免疫细胞估计数增加，而位点不匹配的样本在细胞毒性药物暴露后显示细胞应激通路的增加，反映细胞和代谢应激，但ConsensusTME基因集没有差异。对NACT（新辅助化疗）前后的先天、适应性和细胞毒性细胞（CD8+和NK细胞）进行了多因素分析。匹配部位NACT后的NK细胞和细胞毒性基因组增加，而非匹配部位的NK细胞和NACT后细胞毒性基因组没有差异（图6b）。CD8+和细胞毒性细胞无明显差异，说明NK细胞在NACT作用后大部分浸润并变得活跃。

07

在顺铂治疗后卵巢癌临床前模型中富集NK细胞

对位点匹配样本的ConsensusTME支持分析表明，化疗后细胞毒性NK细胞浸润肿瘤部位。为了实验验证这一发现，使用了两种同基因卵巢癌模型:UPK10和ID8。表型上，UPK10细胞植入小鼠腹腔后，肿瘤体积大，腹水小，而腹腔内ID8细胞植入则导致癌变和腹水。通过然后通过具有免疫能力的小鼠传代生成具有侵略性的ID8细胞系克隆，产生的细胞系导致了癌病和腹水的迅速发展，能够对治疗效果进行早期评估。为了评估顺铂在这些补充模型中的影响，移植有肿瘤的C57BL/6小鼠用顺铂或PBS作为对照，收集肿瘤（UPK10）或腹腔冲洗（ID8）进行多参数流式细胞术（图6 c， d）。顺铂治疗后，NK细胞在腹水ID8模型腹腔液中显著富集，在UPK10肿瘤中也有类似趋势，但富集不显著。在两种模型中均未观察到其他免疫细胞群的显著增加。这些观察结果与位点匹配样本的ConsensusTME预测变化一致，因为在多变量分析中，只有NK细胞和细胞毒性基因集评分在NACT后显著富集（图6b）。

08

化疗可诱导患者T细胞亚群的寡克隆扩增

为了评估NACT前后样本间的T细胞浸润和寡克隆扩增，进行了T细胞受体（TCR）测序测。由于T细胞活化导致特定T细胞克隆型的克隆性扩张，TCR克隆测量可以作为（neo）抗原识别后T细胞激活的替代方法。TCR寡克隆扩增在NACT位点匹配的样本中显著升高（图7a），但在位点不匹配样本中未观察到显著差异。在NACT后位点匹配的样本中，T细胞的比例也显著更高，而在位点不匹配的NACT术后肿瘤中观察到较低的T细胞比例，这可能是由于网膜转移（NACT前活检）和原发肿瘤（NACT去瘤手术后）之间免疫浸润的差异性造成的。重要的是，这些差异与部位匹配的NACT前样本的活检干预无关。探讨了患者间独特的和共享的TCR序列的特征是否可以提供化疗对T细胞扩张的观察效果的进一步细微差别。与位置不匹配的患者组相比，在位置匹配的患者组中，在治疗前和治疗后的样本中观察到更多的共享TCRs（图7 b）。此外，在所有患者中，NACT后具有相同TCRs的样本数量高于NACT前（图7c）。然后比较了每个患者NACT前后共享TCR的数量，以及独有TCR的数量。在位点匹配样本中，NACT处理后的独有 TCRs数量高于NACT处理前的独有 TCRs数量（图7d），而在未匹配的样品中，独有的TCRs在处理前后没有观察到差异。从它们的生产频率可以看出，大多数新的TCRs并没有克隆扩增（图7d）。在位点匹配样本中，没有发现预处理基因特征和NACT诱导的TCR克隆性增加之间有统计学意义上的关联，尽管观察到了一些趋势。综上所述，这些结果证明NACT可诱导HGSOC局部TME的免疫激活，而患者内位点内TME的异质性可掩盖患者肿瘤位点间的临床相关性观察。

小编总结

本工作为了分析高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）在baseline和NACT期间的肿瘤-免疫情况，对化疗前后的未治疗和治疗后配对样本进行了免疫基因组分析。在未治疗的HGSOC中，发现免疫细胞排斥（immune-cell-excluded）和炎症微环境在同一个体和同一肿瘤部位中共存，表明免疫细胞浸润的普遍变异性。分析TME细胞组成、DNA拷贝数、突变和基因表达表明，在未治疗的HGSOC中，免疫细胞排斥与Myc靶基因扩增以及典型Wnt信号表达增加有关。NACT检测到自然杀伤（NK）细胞浸润增加，T细胞寡克隆扩张。本工作证明，晚期HGSOC的肿瘤免疫微环境具有内在的异质性，化疗可诱导局部免疫激活，说明化疗可增强免疫排斥（immune-excluded）的HGSOC肿瘤的免疫原性。

引用：

Jiménez-Sánchez A， Cybulska P， Mager KL， et al. Unraveling tumor-immune heterogeneity in advanced ovarian cancer uncovers immunogenic effect of chemotherapy. Nat Genet. 2020;52（6）:582-593. doi:10.1038/s41588-020-0630-5