Nature microbiology：解析细菌异质性耐药的机理

文章导读：

细菌的异质性耐药（heteroresistance）通常是指某个单一分离菌株，在其培养的群体中存在着对某种药物敏感性不同的亚群，也即有些细胞对该药物敏感，而另一些细胞则存在耐药性，这时便称该细菌为这种药物的异质性耐药菌株。细菌的异质性耐药为药物对致病细菌的治疗效果的评估带来了很大困难，使实验室最小抑制浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）数据的可靠性降低。异质性耐药的机理是什么，这背后又有怎样的生态与进化规律？这篇文章通过一系列详细的证据链进行了回答。

The high prevalence of antibiotic heteroresistance inpathogenic bacteria is mainly caused by gene amplification

致病细菌中抗生素异质性耐药的高发主要由基因扩增造成

作者：Hervé Nicoloff, Karin Hjort, Bruce R. Levin & Dan I. Andersson

期刊：Nature Microbiology (IF=14)

时间：11 February 2019

文章摘要

当选择使用某种抗生素来治疗细菌引起的感染时，通常假定目标细菌对这种抗生素的敏感性是可以通过实验室评估的MIC数据来反映的，从而我们可以选择合适的剂量来有效抑制细菌生长。然而由于异质性耐药的出现，也即抗生素敏感的种群中可能存在具有耐药性的亚种群，使得基于MIC数据进行治疗的方法面临巨大挑战。本文选取41个临床获得的致病菌分离菌株，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella enterica）、克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）以及不动杆菌（Acinetobacter baumannii），研究其对28种不同的抗生素的异质耐药性及其机理。在一共766个细菌-抗生素组合测试中，多达27.4%的组和具有异质性耐药。基因的分析表明大多数的异质性耐药是不稳定的，亚群耐药性的增强起因于自发性的基因扩增，这些扩增的基因包含已知的典型抗性基因。使用数学模型我们展示了敏感致病菌的异质性耐药可以导致抗生素治疗的失败。异质耐药性的高发使得MIC数据作为细菌对抗生素敏感性判断唯一标准的策略面临巨大挑战。基于这些结果，我们需要开发简易、快速识别致病菌异质性耐药的方法。

研究背景

无论过去、现在还是将来，耐药细菌都是抗生素治疗失败的重要因素之一。目前大家普遍认为最小抑制浓度（MIC）是细菌敏感或者耐药的判断标准。MIC数据通常是在有利于药物起作用的条件下获得的，其测试时培养基上细菌生长密度低、处于指数生长阶段且添加抗生素时间较短。然而，基于MIC标准被分类为敏感型的致病菌在长期暴露于抗生素之后可能会表现出耐药性造成抗生素治疗失败。其中一个很重要的原因就是细菌的异质耐药性，也即种群中包含对抗生素敏感性不同的亚群。因为这些亚群的细胞数目较少，难以被MIC数据所反映，然而在长期的抗生素选择下这些本是少数的亚群可能成为主要类群。

尽管异质耐药性这一现象早就被发现，却很少在临床治疗中被考虑，针对临床中所使用抗生素的细菌异质耐药性的出现频次及其对于抗生素治疗失败的相对贡献仍然所知甚少。评估异质耐药性广泛程度的研究相对缺乏，主要由于两个原因，一个是异质耐药性定义及鉴别该性状的方法论的模糊，另一个是目前临床测试抗生素敏感度的方法用于检测异质耐药性仍是十分困难的。而且，与可遗传的耐药性不同，异质耐药性的机理仍然是未知的，导致这种现象经常不被接受。

结果讨论

1. 异质性耐药的高发

假如一个种群内的子集细胞可以生长在至少8倍于整体种群最低抑制浓度（或最高不抑制浓度）的抗生素中，则可以判定具有异质耐药性。本文进一步限制抗性子集的出现频数高于1×10-7，以去除可能的突变的影响。本文按照图1所示的流程对41个临床菌株与28种不同的抗生素进行组合测试。

图1. 测定异质耐药性频率及其遗传机理的方法图解

如图2所示，一共进行了997组实验，其中231组表现出完全耐药性，剩余的766组进行异质性耐药的检测，其中11.4%被确认具有异质性耐药，8.1%无法排除嫌疑。在初始实验检测为阴性的组合中进行进一步筛选，最终有14.7%虽然一开始为阴性，而在后续的测试中又表现为阳性。经过校正的结果表明，有高达27.4%的情况可以表现出异质性耐药。

图2. 所有菌株与抗生素的组合测试及其结果

（上标a: 在非完全耐药的组合中所占的比率 b: 在可用的PAP测试结果中所占的比率 c: 根据PAP结果校正的比率）

2. 异质性耐药是不稳定的

本文对表现出耐药性的亚群进行40代的无抗生素培养，然后再检测其对抗生素的抗性。结果表明88%的亚群其耐药性无法保持，MIC又恢复到最开始整体种群的水平，说明大多数异质性耐药都是不稳定的。为了检测不稳定异质性耐药背后的基因变化，对具有这些性状的细菌的亲代、耐药性亚群、以及失去耐药性的回复体进行全基因组测序。

表1. 有DNA扩增的不稳定的异质性耐药

3. 不稳定的耐药性基于不稳定的基因扩增

不稳定的耐药性可能源于基因的扩增或者频繁的突变事件。如表1所示，在18个测序的不稳定异质性耐药情况中，11个在面临抗生素压力时选择了DNA扩增。相反地，当没有抗生素时，扩增的元件拷贝数目减少，扩增的元件被删除或者携带扩增元件的质粒丢失，从而导致耐药性的降低甚至丢失。通过全基因组测序，在四个物种的病原菌中都发现了串联基因扩增，并且质粒和染色体上均有出现。不同菌株以及施加不同抗生素时扩增基因的拷贝数也有所不同，本文同时通过qPCR验证了全基因组测序的结果。

表2. 没有DNA扩增的不稳定的异质性耐药

本研究发现的扩增区域长度范围从4.2到279.8kb，并且大多数扩增的片段均包含已知的抗生素抗性基因。为了进一步确认抗性基因的扩增是造成异质性耐药的原因，作者做了两个不同的测试。首先，在亲本菌株中删除耐药性子群扩增的基因，结果造成异质性耐药性状的缺失以及MIC数据的降低；然后，按照一定的梯度通过克隆超表达上述基因，可以观察到随着基因表达量的升高，MIC数据也不断升高（图3）。对亲本菌株进行分析发现，在没有抗生素添加时相关基因扩增的自发率大约为1×10-3，说明自然条件下这些区域就有扩增现象的出现，而且出现相当频繁。

图3. 不稳定异质性耐药涉及的潜在基因的超表达

4. 不稳定的耐药性基于点突变和小缺失

在测序的不稳定异质性耐药情况中，也有少部分（7个）在面临抗生素压力时并没有观察到DNA的扩增。但是这些菌株的DNA序列中发现了一些点突变、插入和小的缺失，在8倍于MIC的抗生素选择下这些突变的发生率约为3.7×10-6。这些突变都位于染色体上，其中一些突变发生于与抗生素抗性有关的基因。当没有抗生素出现时，这些变异会保留在DNA序列中，同时会出现一些补偿的点突变、扩增或者功能丢失，从而使抗生素敏感性提高（表2）。

值得注意的是，通过基因扩增获得耐药性的菌株在失去抗生素选择后可以回复到原亲本状态，仍然具备异质性耐药的能力。然而通过突变获得耐药性的菌株其回复体为一新的菌株，并且一些失去了异质性耐药能力。

图4. 亲本菌株与耐药性亚群回复体的生长速率对比

5. 基因扩增与回复过程中的适应成本分析

已有研究表明，串联基因扩增是十分不稳定的，由于不等交换（unequal crossing over）同源的多拷贝很容易丢失。并且，在没有抗生素选择下含有基因扩增的耐药细胞生长速率要远小于无扩增的敏感细胞。这两个原因的结合，导致基因扩增只作为一个小概率事件存在于种群中。为了证明这一点，作者对比了亲本菌株、耐药性亚群以及回复体的生长速率，发现在无抗生素选择时耐药性亚群的适应成本比另外两者高22-46%（图4）。

图5. 异质性耐药的分子机制

6. 异质性耐药的药效学及潜在临床意义

最后，作者使用数学模型来分析异质性耐药造成治疗失败的药效学条件。结果表明，使用现实的参数值异质性耐药常常会造成临床治疗失败，异质性耐药对于药学实验是一个巨大的挑战。鉴于异质性耐药非常普遍以及通过标准实验难以判断，对于致病菌耐药性的误判是常见的而且因此造成很多治疗失败。因此，对临床致病菌的深入研究以及开发广泛适用的异质性耐药鉴别方法是非常迫切的。

总结评论

基因扩增（gene amplification）为细胞内的一些基因其拷贝数选择性的增加，而其他基因并未按比例增加的现象。基因扩增本质上属于一种调控手段，并非可遗传的变异，是为了特定情况下产生足够的基因产物而出现的。在细胞内基因扩增有多种实现方式，例如通过滚环复制产生包含目标基因的染色体外环状DNA、DNA不切离多次复制形成网状结构的复制泡、在染色体上多次复制形成串联重复，或者将带有目标基因的质粒进行多次扩增等。基因扩增只是特殊时期的一种调控策略，而失去这种需要后为了节约代谢成本这种现象就会逐渐消失。

本文对临床分离的致病菌以及多种不同的抗生素进行了大规模的异质性耐药测试，同时基于PacBio和Illumina平台进行全基因组测序，并使用qPCR、基因敲除、过表达等方法进行验证，证明了致病菌的异质性耐药主要是基因扩增造成的。进一步的分析表明，相关区域是有自发扩增潜能的，也就是说在自然群体中这种扩增与丢失扩增都以一定的概率发生着，而抗生素的选择会使得扩增现象被富集从而增强耐药性，失去抗生素的选择后多拷贝的丢失主导恢复到之前的敏感水平。

从进化的角度来看，由于抗生素的作用过程是相当快的，而抗生素基因表达以及表达产物作用于抗生素是相对慢的过程，因此通过大量增加相关基因的拷贝数以迅速提高表达产物的浓度是合理的。而在自然种群中以一定的概率维持这种扩增现象，即降低了代谢成本，又保存了抗生素抗性能力。只不过致病菌这种“明智”的选择，并不是我们人类所希望的。