8+新热点：外泌体+公开数据的预后相关分析~

导语

肿瘤衍生的外泌体（TEXs）参与肿瘤进展和免疫调节过程，并介导肿瘤微环境中的细胞间通讯。尽管外泌体被认为是用于疾病诊断的有前途的液体生物标志物，但很难区分 TEXs 和开发基于 TEXs 的预测性生物标志物。

背景介绍

外泌体已经成为最新的生命科学热点，今天小编为大家带来的这篇文章，作者进行了肿瘤衍生外泌体特征的单细胞分析，以及和预后和免疫治疗反应相关研究，文章发表在《Journal of Translational Medicine》上，影响因子为8.44，文章题目为：Single-cell analysis of a tumor-derived exosome signature correlates with prognosis and immunotherapy response。

数据介绍

本研究所用单细胞数据来自NCBI BioProject。从TCGA和GEO中获取了RNA测序数据和样本的临床信息。

技术路线

本研究技术路线如图所示。

结果解析

01

肿瘤衍生外泌体相关评分的构建

为了表征肿瘤源性外泌体，本研究总共选取了33个肿瘤源性外泌体相关基因，并将其分为三个模块。模块1包含来自细胞外囊泡相关基因标记的基因，该蛋白在恶性胸腔积液的细胞外囊泡中检测到。模块2中的基因包括膜转运与融合蛋白(FLOT1)、tetraspanins (CD9, CD63, CD81)、伴侣蛋白(HSP70)、整合素(ITGA1, ITGB1)和多泡体合成蛋白(ALIX, TSG101)，这些基因在多项研究中被认定为经典的外泌体标记基因。模块3包括控制TEX分泌的基因。对所选基因的GO和KEGG富集分析显示，TEX基因富集在与外泌体形成和释放相关的通路中。此外，肿瘤进展通路，如PI3K-Akt信号通路，与TEX基因显著相关。

图 1

因此，本研究认为上述筛选的基因与外泌体的形成和分泌特征以及肿瘤进展特征相关。接下来，本研究利用PCA算法对筛选的基因进行整合，定义了肿瘤来源的外泌体相关特征(TEXscore)，该特征也能在一定程度上反映TEX特征。

首先，本研究试图在单个癌细胞维度上检查TEXscore。从接受酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的单细胞RNA-seq数据中，本研究将3754个癌细胞聚集在一起，通过无监督图的聚类分析得出几个聚类。对于每个癌细胞，计算TEXscore（图1A）。与治疗前(Pre)和部分缓解(PR)/疾病稳定(SD)状态下相对较低的TEXscore相比，当肿瘤获得耐药时，癌细胞在进展性疾病(PD)状态下的TEXscore增加，这意味着TEXscore与治疗中的癌症进展之间存在关联(图1B,C);此外，本研究使用PCA算法分别建立了三个模块生成的外泌体相关签名，得出了相似的结论，即在PD状态下TEXscore和外泌体相关签名评分显著升高(图1 C)。

02

肿瘤样本和正常组织的TEXscore不同

接下来本研究评估了肿瘤样本和正常组织中的TEXscore。在GSE33479队列中，第0期和第1期代表正常支气管黏膜组织，在更晚期恶性程度增加，其中第8期包括肺鳞状癌组织。本研究还发现TEXscore从正常组织到侵袭性肿瘤样本保持线性增长(图2 A)。接下来，本研究试图在泛癌中验证肿瘤样本和正常组织之间的不同TEXscore水平。在TCGA-泛癌队列中，除了TCGA-GBM、TCGA-SKCM和TCGA-KIRC外，大多数癌症类型的TEXscore均有所增加，这表明TEXscore与肿瘤特征相关(图2 B)。TEXscore在TCGA-LUAD、TCGA-LUSC、TCGA-OV和TCGA-PRAD队列中能够区分肿瘤和正常组织(图2 C-F)。

图 2

03

TEXscore的泛癌调查及其与预后的关联

接下来，本研究展示了 17 种 TCGA 癌症类型的泛癌 TEXscore，癌症类型按 TEXscore 中位数排序（图3 A）。高 TEXscores 显示在 TCGA-PRAD、TCGA-BRCA、TCGA-ESCA、TCGA-HNSC、TCGA-READ、TCGA-LUSC、TCGA-GBM 和 TCGA-LUAD，表明这些肿瘤容易产生更多的 TEX（图3 A）。高 TEXscore（作为连续变量和分类变量）与较差的临床结果相关，表明它在预测大多数癌症类型的总体生存率方面具有很大的能力，特别是在 TCGA-LUSC、TCGA-LUAD、TCGA-STAD等癌症中（图3 B–F)。尽管 TCGA-COAD、TCGA-ESCA、TCGA-LIHC、TCGA-KIRC 和 TCGA-READ 显示了反向生存差异，但只有后两种类型显示出统计学上的显著差异。在 TCGA 泛癌综合队列中，TEXscore 说明了对总生存期的稳健预测价值（图3 G）。

图 3

04

TEXscore预测对免疫检查点阻滞剂的治疗反应

接下来，本研究使用接受抗 PD-L1 治疗的转移性尿路上皮癌患者的 IMvigor210 数据集来分析 TEXscore 在筛选具有潜在治疗益处的患者中的表现。Kaplan-Meier 曲线表明，较高的 TEXscore 与 IMvigor210 中延长的存活时间有关（图4 A，B），与此相同的是无反应组 (SD/PD)与ICB组的 TEXscore 升高（图4 C，D）。

图 4

值得注意的是，TEXscore 随着肿瘤细胞 (TC) PD-L1 水平的升高而升高，反映了肿瘤细胞上的 PD-L1的 表达，从而进一步验证了 TEXscore 是一种肿瘤特异性的生物标志物（图4 E）。为了确定更多有助于其对 ICB 的预测能力的潜在机制，本研究使用 IMvigor210 队列中高和低 TEXscore 亚组之间的 DEG 进行功能富集分析。结果发现高 TEXscore 亚组中上调的基因富集于细胞外基质 (ECM) 重塑相关通路，表明外泌体释放和摄取过程可能触发 ECM 成分的改变（图4 F，G）。此外，GSEA结果和KEGG分析共同阐明了在高TEXscore亚群中上调的基因参与了肿瘤相关的信号通路，包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和癌症通路（图4 F-H)。这些通路强调了肿瘤的恶性特征，是导致 ICB 治疗期间反应不理想的原因。

05

TEXscore与免疫抑制微环境相关

随后，本研究整合了涵盖巨噬细胞、癌症相关成纤维细胞 (CAF)、髓源性抑制细胞 (MDSC)、上皮-间质转化 (EMT) 和调节性 T 细胞 (Tregs) 的综合免疫抑制特征，以表征 TEXscore 和肿瘤微环境之间的关系。 结果发现在TCGA 数据集中，不同肿瘤类型的免疫抑制微环境模式显著不同（图5 A）。

图 5

也就是说，与大多数癌症类型相比，TCGA-SKCM、TCGA-UCEC、TCGA-LIHC 和 TCGA-GBM 与免疫抑制特征呈负相关，因此在 TEX 分泌方面可能存在相当大的肿瘤间异质性。同时，TEXscore 与大多数癌症类型中广泛的免疫抑制信号以及免疫治疗耐药性显著相关（图5 B-E）。此外，包括 CAF、MDSC 和巨噬细胞在内的免疫抑制细胞与 IMvigor210 数据集中的 TEXscore 呈正相关，共同验证了 TEXscore 作为 ICB 的负面指标。

06

TEXscore相关的miRNA介导肿瘤生物学机制

异常的 miRNA 活动在不同的癌症环境中很常见。目前，大量研究集中在 miRNA 作为外泌体cargos的功能上。因此，本研究试图研究 TEXscore 和 miRNA 之间的关系。TCGA-Pan-Cancer 队列中共有 1882 个 miRNA，本研究剖析了它们与 TEXscore 的关系。结果发现消化系统肿瘤和泌尿系统肿瘤，如 TCGA-STAD、TCGA-READ、TCGA-COAD、TCGA-BLCA 和 TCGA-PRAD，与这些 miRNA 表现出广泛的联系（图6 A）。另外本研究还发现，这些鉴定出的 miRNA 主要作为肿瘤抑制因子发挥作用，并且它们在高 TEXscore 组中被下调（图6 B）。

图 6

由于 miRNA 可以通过与靶 mRNA 的 3'UTR结合来抑制特定基因的表达，本研究试图获得上述 miRNA 的靶 mRNA 列表。为了进一步剖析 TEXscore 相关 miRNA 在高 TEXscore 设置中发挥的功能，本研究选择了前 10 个阴性 miRNA 的总共 2628 个靶基因用于进一步的 GO 和 KEGG 富集分析。结果发现，GO富集分析表明靶mRNA在神经发生过程中富集，包括轴突形成、突触组织和神经元投射（图6 C）。除了 ECM 重塑机制，KEGG 富集分析表明高 TEXscore 组中减少的 miRNAs 参与了多种肿瘤发生信号通路（Ras 信号通路、PI3K-Akt 信号通路和 MAPK 信号通路）（图6 D）。

07

TEXscore与稳定的基因组条件有关

本研究分析了TEXscore和常见基因的基因组谱。TCGA-LUAD队列中STK11突变环境下TEXscore显著降低(图7 A)，这与之前的研究一致，即野生型LKB1恢复增强外泌体释放。同样，野生型TP53在外泌体生物发生中起着至关重要的作用，在TCGA-STAD和TCGA-CESC队列中与TEXscore密切相关(图7 B, C)。接下来，本研究专注于整个TEXscore基因的改变率。来自TEXscore的基因在TCGA-BLCA和TCGA-STAD中突变率相对较低，而在NSCLC中突变率较高。EGFR突变是NSCLC中最常见的驱动突变。另外，在TCGA-LUAD的高TEXscore组中观察到高EGFR改变频率，而在低TEXscore组中STK11突变占主导(图7 D-E)，这共同表明STK11和EGFR介导对外泌体分泌的反向作用。

图 7

小编总结

本研究开发了一个捕获 TEX 特征的基因表达特征 (TEXscore)。此外还证明TEXscore 与免疫抑制微环境显著相关，具有评估预后和预测 ICB 反应的潜力。本研究的限制在于TEXscore 是基于来自肿瘤组织的 RNA-seq 数据建立的，应该对其进行优化以应用于液体活检。在目前的研究中，TEXscore 特征是依赖于外泌体相关基因整合建立的，因此需要通过实验研究来进一步验证 TEXscore 基因在外泌体中的表达水平，并确认 TEXscore 与临床结果之间的关系。总之，这篇文章向大家展示了外泌体相关的分析思路，希望能对大家有所启发！