新角度：12+！非小细胞肺癌肿瘤免疫微环境与预后分析~

更好地了解肿瘤免疫微环境 (TIME) 将有助于开发预后生物标志物和更有效的肺癌患者治疗策略。然而，TIME中关于癌细胞、免疫细胞和局部免疫抑制元素之间复杂相互作用的综合评价的报道却很少。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章对TIME相关基因集进行了单样本基因集富集分析，开发了一个新的评分系统（TIME score），其中该评分系统由T-score（肿瘤增殖）、I-score（抗肿瘤免疫）和S-score（免疫抑制）组成。文章发表在《Journal for Immunotherapy of Cancer》上，影响因子为12.469，文章题目为：New evaluation of the tumor immune microenvironment of non- small cell lung cancer and its association with prognosis。

数据介绍

本研究对 113 例肺癌进行了孔外显子组测序和 RNA 测序。通过cbioportal访问肺癌患者的 TCGA 数据集。还利用了接受 ICI 治疗的黑色素瘤患者队列（GSE78220、GSE91061）。

技术路线

本研究技术路线如图所示。

结果解析

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患者特征

本研究共分析了 113 例肺癌病例。表 1 总结了这些患者的临床病理特征。

表1

02

TIME评分与临床特征、流式细胞术和基因表达数据的关联

为了评估 TIME 中癌细胞、免疫细胞和局部免疫抑制元素之间的复杂相互作用，本研究开发了一种基于三个主要因素（肿瘤增殖、抗肿瘤免疫和免疫抑制）的新评分系统。本研究专注于与这些TIME因素相关的九个基因集，如图 1A 所示。本研究使用来自 113 个肺肿瘤样本的大量 RNA-seq 数据执行 ssGSEA，将与有丝分裂纺锤体和糖酵解相关的基因组的 z 分数分配给肿瘤因子（T-score）。T 细胞和 B 细胞，以及 MHC 蛋白复合物被分配给抗肿瘤免疫因子（I-score）。最后，炎症细胞因子产生、血管生成、缺氧和 EMT 的抑制被分配给免疫抑制因子（S-score）（图 1A）。基因组的每个 ssGSEA 分数与T-score、I-score和 S-score的相关系数计算如图 1B 和 C 所示。

T细胞的评分与B细胞评分和I-score中的 GO_MHC_PROTEIN_COMPLEX 相关（图 1B）。HALLMARK_ANGIOGENESIS、HALLMARK_HYPOXIA 和 HALLMARK_EMT 的分数在 S-score中强相关（图 1B）。S-score中的 GO_NEGATIVE_REGULATION_OF_CYTOKINE_PRODUCTION_INVOLVED_IN_IN_INFLAMMATORY_RESPONSE 评分与 I-score中的 T 细胞、B 细胞和 GO_MHC_PROTEIN_COMPLEX 评分中度相关（图 1B）。T-score和I-score呈负相关，而 I-score和 S-score呈正相关（r=0.48，p<0.001，图 1C）。

图 1

接下来，本研究研究了每个TIME评分与临床病理特征或流式细胞术和基因表达数据之间的关系。T-score与病理分期、组织学分级、浸润性病灶大小、FDG- PET最大标准化摄取值呈正相关(图1D)。流式细胞术检测肿瘤组织FTD中CD3+、CD19+细胞比例与I-score相关(图1E)。根据GZMA和PRF1信使RNA的表达水平估计，I-score也与细胞溶解活性(CYT)相关，这与细胞毒性T细胞浸润和活性相关(图1 E)。

最后，通过流式细胞术，S-score与 FAP 阳性细胞的频率相关，这与 CAF 和 CD31+ 内皮细胞相关(图1 F)。S-score还与M2巨噬细胞、基质细胞和内皮细胞丰度以及抗炎细胞因子基因(TGFB1和IL- 10)和免疫检查点分子基因(CTLA4、PDCD1 (PD- 1)、HAVCR2 (Tim- 3)和LAG3)的表达相关。这些数据表明，基于 TIME 的 T 评分、I 评分和 S 评分与实验数据一致，并可能反映肺癌患者的临床特征。

03

根据TIME评分，代表性组织学和驱动突变的分布

为探讨T-因子、I-因子、S-因子之间的动态相互作用，本研究将113例肺癌患者按照T-score(T)、I-score(I)、S-score(S)的高低组合进行分层，将患者分为8组:第1组(G1)。Tlo/Ilo/Shi，第2组 (G2)。Tlo/Ilo/Slo，第三组(G3)。Tlo/Ihi/Shi，第4组 (G4)。Tlo/Ihi/ Slo，第五组(G5)。Thi/Ilo/Shi，第6组(G6)。Thi/Ilo/ Slo，第7组(G7)。Thi/Ihi/Shi，第8组(G8)。经z- score归一化的各基因集热图及八组临床数据如图2A所示。

本研究首先检查了每个TIME评分与癌症典型组织学类型之间的相关性。与G5- 8相比，腺癌在G1- 4的发生率较高 (图2B左边)，相比之下，Thi组的鳞状细胞癌高于Tlo组。然而，这些组织型在Ilo和Ihi或Slo和Shi状态下的频率没有显著差异(图2B中、右)。

图 2

接下来，基于WES数据(图2C)和靶标测序数据，研究复发性驱动突变。表皮生长因子受体(EGFR)突变在Tlo组中出现的频率高于Thi组(图2D左)，Thi组TP53突变频率高于Tlo组。在Ilo组和Ihi组以及Slo组和Shi组之间，EGFR或TP53的突变频率没有差异(图2D中、右)。

04

单核苷酸变异、新抗原和免疫选择压力

突变衍生的新抗原被认为是抗肿瘤免疫应答和免疫编辑的关键靶点。因此，本研究接下来调查了8组中单核苷酸变异(SNVs)、p- neoAgs和e-neoAgs的数量(图3A-C)。Thi组的SNVs和p-neoAgs数量高于Tlo组，两组间e-neoAgs数量差异无统计学意义。

免疫选择压力可通过抑制含有新抗原的转录本来消除肿瘤亚克隆或影响新抗原的表达，某些免疫原性癌症在肿瘤突变总数中表现出新抗原突变的优先耗尽。为了测试肺癌亚组是否也同样适用，本研究比较了观察到的新抗原与预期的新抗原的比率，以及先前报道的每一个体细胞突变的新抗原的比率。然而，各组之间没有显著差异(图3D)。

图 3

接下来，本研究比较了e-neoAgs和p- neoAgs的比率，本研究将其称为“新抗原表达比率”(图3E)。尽管Thi组的这一比例略高于Tlo组(p=0.036;在线补充图S8E)，该分析中额外纳入I-score状态显示，Thi/Ihi组(G7,8)的比率显著低于Thi/Ilo组(G5,6)，相比之下，Tlo/Ihi组(G3,4)的比值并不低于Tlo/Ilo组(G1,2)。这些结果表明，对新抗原信使RNA (mRNA)表达的免疫选择压力可能只发生在新抗原负荷高的Thi组(G5- 8)，而在Thi/Ilo组(G5,6)可能被抑制。

05

TILs和免疫应答对TIME评分的影响

本研究特别关注了Thi (G5- 8)组，因为这些组对新抗原的免疫选择压力可能最强。与 Thi/Ihi (G7,8) 相比，Thi/Ilo 组 (G5,6) 的 CYT 评分和 IFN-γ mRNA 较低（图 3F 和 G。由IFN-γ诱导的MHC I类和PD- L1的表达模式与IFN-γ的表达相似(图3H-J)。在“缺失自我”识别中，没有观察到MHC I类表达与自然杀伤细胞评分的负相关(图3K)。此外，在Thi/Ilo中，表达CD39和CD103细胞表面标记物的肿瘤特异性但耗尽的CD8+ T细胞往往更高(G5,6)，尽管这些组中CD3+细胞的频率相当低(图3L和M)。

本研究接下来研究了自体肿瘤细胞攻击培养TILs产生IFN-γ的情况。Thi/ Ilo/Shi (G5)在Thi组中表现出最低的 IFN-γ 产量（图 3N）。总之，在Thi/Ilo G5和G6组中，TILs数量有限，可能耗尽，以及肿瘤MHC I类表达降低可能限制了对新抗原的免疫选择。

06

TCGA队列中肺癌的TIME评分及其与生存的关联

接下来本研究检查了TIME评分对预后的影响。如图4A所示，OS表明T-score、I-score和S-score是显著的预后因素。此外，根据年龄、性别、病理分期和组织学调整的Cox比例风险模型显示Thi和Shi是独立的不利预后因素，Ihi是独立的有利预后因素(图4 B)。8组间OS差异明显(图4C)， Thi/Ilo/Shi G5组预后最差，相反Tlo/Ihi/Slo (G4)组预后最好。

由于 Tlo (G1-4) 和 Thi (G5-8) 之间的免疫压力水平不同，本研究接下来进行了亚组分析，发现所有 Tlo 组的 OS 相似。在 Thi 组中存在统计学上的显著差异（图 4D），主要原因是S-score而不是I-score。因此，与 G6 (Thi/Ilo/Slo) 或 G8 (Thi/Ihi/Slo) 相比，G5 (Thi/Ilo/Shi) 患者的预后较差。这些结果表明免疫抑制更可能影响所有 Thi 组 (G5-8) 患者的预后。

图 4

最后，本研究将TIME评分与之前报道的其他预后评分或因素进行比较。如图4E所示，TIME评分预测OS的接受者操作特征(ROC)优于CYT、TIS (Tumor Inflammatory score)、微环境评分(xCell)或免疫评分(xCell)，但与传统TNM分类相当，并不优越。

06

肺癌的致癌信号通路、TIME评分与预后

肿瘤发生的共同驱动因素调节肿瘤免疫环境。因此，本研究根据Sanchez-Vega 的方法评估致癌信号通路的改变，并探讨其与肺癌T-score、I-score和S-score的相关性。如图5A所示，与Tlo组相比，Thi组中致癌信号通路相关基因(p53、RTK- RAS、PI3K)的突变率更高，而在Ilo组突变率更高(p53, RTK- RAS, PI3K和WNT)。相应地，在有这些改变的组中，T-score显著升高，而I-score显著降低(图5B)。然后本研究调查了通路改变对肺癌患者预后的影响。仅PIK3通路改变的肿瘤患者预后较差(图5C)。这些结果表明，PI3K通路改变与肺癌患者预后不良相关，其T-score较高，I-score较低。

图 5

小编总结

本研究提出的TIME 评分可以捕捉肿瘤增殖、抗肿瘤免疫和免疫抑制之间复杂的相互作用，可用于肺癌患者的预后预测或治疗策略的选择。其中Thi (G5-8) 肿瘤的体细胞突变和预测的新抗原数量高于 Tlo (G1-4) 肿瘤。针对新抗原表达的免疫选择压力仅发生在 Thi 中，并在 Thi/Ilo (G5-6) 中减弱，这可能是由于 T 细胞数量减少，其中肿瘤特异性细胞比例高但已耗尽。Thi/Ilo/Shi (G5) 通过额外的免疫抑制机制显示出最低的免疫反应。T-score、I-score和S-score是独立的预后因素，生存曲线很好地分为八组，其中 G5 显示最差的总生存期，而相反组 Tlo/Ihi/Slo (G4) 的预后最好。几种致癌信号通路影响 T-score和I-score，但不影响S-score，并且根据较高的 T-score和较低的 I-score，PI3K 通路改变与不良预后相关。

这项研究有几个局限性。首先，该评分模型并未涵盖癌症的所有特征，60 因此可能会遗漏肺癌 TIME 的某些方面。其次，由于本研究的生存数据太不成熟，无法评估早期肺癌。第三，使用单个肿瘤区域评估 TIME 评分，因此本研究未考虑同一患者的肿瘤异质性。

本研究提出了一种肿瘤免疫微环境分析的新角度，很值得大家学习借鉴！