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JCIM｜EHreact:用于酶促反应模板提取和评分的扩展Hasse图

每个图可以用来输出一个或一组反应规则（酶反应模板）。此外，它还可以计算出在给定酶的情况下该酶催化新底物的概率（预测其在非天然底物上的适用性）。...其中，酶反应的反应规则的生成尤其具有挑战性，因为酶之间的底物混杂性差别很大，这导致了规则特异性的最佳水平和包含的原子的最佳数量在不同酶之间差别巨大。...从另一方看，从数据库中自动提取酶反应的数据的困难促进了手工管理反应规则集的创建。 大多数酶在某种程度具有混杂性，换句话说，它们可以被改造以接受新底物。 在反应途径设计的实践中，适度混杂的酶是首选。...其中，最重要的是提高评分函数的准确度，从而正确地对预期可行的反应进行排序。然而，依赖于相似性或反应规则特异性的方法无法区分通用酶和专用酶，即它们缺少对酶的混杂性的描述。...2.5数据准备 作者从文献中手工提取了一系列关于各种酶的底物范围的实验研究，以及有机偶联反应的研究，来测试EHreact对有机、非酶促反应的性能。

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    细胞转染、重组蛋白、荧光素酶检测试剂盒实验 | MedChemExpress

    “六合心法”第三式 ■ 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit) 荧光素酶是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称，可催化荧光素氧化成氧化荧光素...这一反应体系广泛用于启动子转录活性调控和 miRNA 靶基因验证等方面的研究。...目前最常见的荧光素酶是萤火虫荧光素酶 (Firefly luciferase) 和海肾荧光素酶 (Renilla luciferase)，前者用于荧光素酶报告基因的检测，后者则作为内参，消除细胞生长状态...本心法中的 Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit 含有高纯度的 D-荧光素、腔肠素以及比例优化的反应缓冲液，可实现哺乳动物细胞双萤光素酶报告基因检测，操作简单...Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit 含有高纯度的 D-荧光素、腔肠素以及比例优化的反应缓冲液，实现哺乳动物细胞双萤光素酶报告基因检测。

    47710

    ELISA简介及基于夹心法的PK方法学开发实例

    ELISA实验方法类型 在ELISA实验中，抗体或者抗原需预结合到酶标板中，再利用辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷脂酶（AP）或者其他化学发光基团标记的抗体或者抗原进行显色反应。...2.1 夹心法 夹心法的基本原理是将抗体（抗原）包被到酶标板上，加入待检测样品后，再加入HRP、AP标记的检测抗体，通过显色反应测定待测样品中的特定抗原（抗体）含量。...与其他几种方法最大的区别是，在实际操作中样品中待测物质浓度越高，显色反应越低；反之，当待测物质浓度越低，显色反应程度越高。...这是因为，将抗原固定在酶标板之后，加入待测样品和酶标检测抗体，样品中游离的待测抗原会与酶标检测抗体结合，导致酶标检测抗体与酶标板固相抗原结合数量减少，最终显色反应水平光密度值减少。 [竞争法] 3....终止液 加入显色液等体积的1M 盐酸或硫酸溶液终止反应，孔中反应液由蓝色变为黄色。

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    基于荧光素酶报告基因系统的信号通路与基因转录活性检测

    一、报告基因检测技术的原理与应用价值荧光素酶报告基因检测是一种广泛应用于生物医学研究的强大工具，用于在活细胞或细胞裂解物中定量、实时地监测特定信号通路的活性或基因的转录水平。...通过加入特异性底物，荧光素酶催化氧化反应并产生生物发光信号，该信号的强度与荧光素酶的表达量成正比，从而间接、灵敏地反映目标信号通路或转录调控事件的活性。...血清反应元件（SRE）报告基因系统是用于检测该通路活性的经典工具。当ERK1/2被上游信号磷酸化并激活后，会转位至细胞核内，磷酸化并激活三元复合物因子（如Elk-1）。...激活的转录因子复合物与报告质粒上的SRE序列特异性结合，从而驱动荧光素酶基因的转录与表达。因此，通过检测荧光素酶的活性，即可定量评估MAPK/ERK通路的激活程度。...3.荧光素酶活性检测：处理结束后，裂解细胞。使用UA-Glo®Bio-lucLuciferaseAssaySystem按顺序检测萤火虫荧光素酶（实验组）和海肾荧光素酶（内参组）的活性。

    22910

    从零开始学PCR技术（一）：PCR技术简介

    聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一项利用 DNA 双链复制原理，在生物体外复制特定 DNA 片段的的核酸合成技术。...聚合酶链式反应简图 三、结果检测 PCR 反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。...特异性强 PCR 反应的特异性决定因素： 引物与模板 DNA 特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq 聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。...热启动 PCR（hot start PCR）：以高热激活型核酸聚合酶进行反应，减少非专一性产物。...Digital-PCR：将标准的 PCR 反应分割至每一个反应中仅 1~2 个 copy。藉以侦测微小比例的基因差异。应用于：癌症突变基因、病原体检测、借由母血对胎儿做产前检测。

    1.6K10

    分子生物学实验技术——荧光素酶实验

    荧光素酶报告基因实验就是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。 荧光素酶（Luciferase）：是能够催化底物氧化发光的一类酶的统称。...荧光素酶可以催化luciferin被氧化成oxyluciferin的反应，在luciferin被氧化的过程中会发出生物荧光，然后可以通过仪器测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。...3️⃣加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。...✅荧光素酶报告基因的优点 蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。 在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。...与绿色荧光蛋白（GFP）不同，它们的发光检测不需要激发光激发，且发光穿透力更强，这使其具备可定量、高灵敏度及低背景等特点 海肾荧光素酶催化的发光反应需要腔肠素和O2的参与，发光颜色为蓝色。

    1.8K30

    Drug Discovery Today| 频繁命中化合物：高通量筛选中需警惕的假阳性结果

    图2频繁命中化合物中（A）胶体聚集化合物、（B）荧光酶抑制剂、（C）自荧光化合物和（D）化学易反应化合物的主要干扰机制 3 荧光酶抑制剂 荧光酶检测技术，主要是利用生物荧光酶探测实验中ATP浓度从而判断酶的活性高低...2019年在PubChem登记检测方法的约4400个高通量筛选实验中，14%的实验是基于生物荧光酶进行检测，49%的实验是基于荧光基团进行检测。...荧光酶检测干扰主要分为两类：特异性抑制（即对荧光酶的特异性抑制，图2B）和非特异性干扰（使酶失活或通过光吸收衰减光信号）。...为了防止荧光抑制剂产生的假阳性结果，常用的实验检测手段是双荧光酶检测方法（例如FLuc和RLuc组合检测）、交互实验或选择其他不同检测方法。...图3常见频繁命中化合物或子结构（A）荧光酶抑制剂、（B）自荧光化合物和（C）化学易反应化合物 4 自荧光化合物 通过荧光基团检测相关生物分子浓度是高通量筛选中另一重要检测手段。

    1.3K40

    pacbio测序原理

    3、均匀的覆盖率：SMRT 不需要扩增过程，不受 GC 偏向影响，所有片段的覆盖率均相同； 4、可直接检测碱基上的化学修饰：在通过 DNA 聚合酶的时候，有化学修饰的碱基的通过速度较慢，这种减慢可以反应在荧光信号的间隔上...4、聚合酶活性（Polymerase Read）可支持 30k（40-70K）的读长反应，插入片段长度 5k，那么理论上可获得 6X 的 insertion 信息即正负链各读取 3 次（不计算接头）...这样就可以判断该位置的 DNA 被甲基化了； 8、DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一，SMRT 测序中不含有 PCR 扩增，测序过程中，随着 DNA 聚合酶的合成反应，碱基配对并测序，因此酶活性决定了最终测序读长...在 ZMW 孔底动弹不得的 DNA 聚合酶根据碱基互补原则“抓住”对应的 dNTP准备发生聚合反应，酶从抓住到开始聚合反应的时间大概约 10ms（此时该目标碱基的荧光基团被持续激发），而 ZMW 孔底部游离的...DNA 聚合酶介导的延伸反应会沿着一个方向进行，在下一个 dNTP 添加之前，前一个 dNTP上的荧光基团会从复合物上脱落下来，所以单独的一个碱基检测到的荧光信号只会持续很短的一段时间，根据检测到的不同波长和峰值以及他们之间的间隔

    7.6K20

    染色质免疫沉淀(ChIP)实验(附视频)

    接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先用甲醛处理细胞，使蛋白质与 DNA 交联，然后用微球菌核酸酶进行消化，进行免疫反应之后，解除蛋白质DNA 的交联，最后回收得到的 DNA。...另外，酶反应的条件比较温和，对 DNA 和DNA与蛋白的复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。...每个 IP 反应管中加入 20μl 琼脂糖树脂，混匀，置于摇床上， 4℃条件下孵育 1h。琼脂糖树脂孵育后，将整个反应体系转入 2ml 的含离心柱的收集管中。...此时可将得到的 DNA 进行 PCR 检测。 DNA 纯化回收 孵育结束后，往每个 IP 反应管和 Input 对照管加入 750μl DNA Binding Buffer，混匀。...Input 是断裂后的基因组 DNA，需要与沉淀后的样品 DNA 一起经过逆转交联， DNA 纯化及最后的 PCR 或其他方法检测。

    2.7K22

    抗体标记服务｜FITCAlexa Fluor偶联｜流式细胞与ELISA应用

    通过抗体偶联服务，将各类功能性标签精准地连接到抗体分子上，使得目标检测更加灵敏和特异。荧光抗体标记和酶标抗体偶联，是目前应用最为广泛的两种技术路线。...一、抗体标记服务的技术基础抗体标记服务的核心在于将荧光染料或酶标签，通过化学反应稳固偶联到抗体分子特定位置。FITC标记抗体通常通过NHS酯与抗体中赖氨酸残基的氨基共价结合，反应温和且高效。...相比之下，Alexa Fluor标记抗体因其高亮度与光稳定性，已成为多色荧光检测的首选。酶标抗体偶联以HRP标记抗体为典型代表，广泛应用于各种免疫分析实验。...生物素抗体标记利用生物素-亲和素系统，实现信号放大，极大提升了检测灵敏度。抗体染料偶联技术讲求反应条件的精确控制，以保证抗体活性不被破坏，同时避免非特异性结合。...多重标签抗体更是在单次实验中实现多靶点检测，提升实验效率与数据丰富度。免疫组化抗体偶联则利用酶标抗体偶联技术，如HRP标记抗体，进行组织或细胞切片中特异蛋白的染色定位。

    30610

    实时定量PCR（RT-qPCR）实验操作流程

    RT-qPCR 基本原理和概念 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。...TaqMan探针法： 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条...RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量，而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。...其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 ?...这个试剂盒是采用嵌合荧光检测法，TB Green 与双链 DNA 结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的 TB Green 荧光强度，达到检测 PCR 产物扩增量的目的。具体原理见下图。

    87.8K3146

    一文读懂：PCR，qPCR，Real-time PCR，RT-PCR和RT-qPCR

    PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是美国科学家Kary B. Mullis 1985年发明的一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。...通过一系列精心设计的反应步骤，PCR可以在短时间内将微量的DNA片段扩增到足够数量，用于后续的研究和检测。...② 低温退火：将温度降至55到60摄氏度之间，使得引物与模板DNA单链按碱基互补配对的原则结合，形成局部双链； ③ 适温延伸：再将温度调至72℃左右（DNA聚合酶最适反应温度），DNA模板和引物结合物可被...在整个PCR反应过程中，借助对荧光信号的强弱进行检测实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测检测样品进行定量分析。...RT-PCR 结合了反转录（Reverse Transcription）和聚合酶链式反应（PCR）的过程。

    6.8K22

    Elabscience 巨噬细胞代谢攻略：解锁 M1M2 极化的能量密码

    巨噬细胞极化是免疫反应调节的关键环节，而代谢过程在其极化及功能发挥中占据核心地位。...同时，M1巨噬细胞在TCA循环中有两个偏离点：一个发生在异柠檬酸脱氢酶，另一个发生在琥珀酸生成后，这两个偏离点可导致柠檬酸盐和琥珀酸盐浓度增加。...M1型巨噬细胞主要通过诱导一氧化氮合酶（iNOS）将精氨酸转化为一氧化氮（NO），发挥杀菌和促炎作用；而M2型巨噬细胞则通过精氨酸酶将精氨酸转化为鸟氨酸，参与组织修复和胶原蛋白合成等过程。图1....结果显示，反应糖酵解速率的ECAR增加，反应OXPHOS的OCR减少，说明巨噬细胞M1极化过程中的能量依赖于糖酵解代谢增加。图3....巨噬细胞精氨酸代谢检测结果图5. BMDM巨噬细胞诱导M1和M2型极化后，检测细胞内精氨酸酶活性（E-BC-K848-M）。结果显示，M2型的精氨酸酶活性显著增加，M1型无变化。

    91710

    干货分享 | 活性氧 ROS 检测攻略大全！| MedChemExpress (MCE)

    许多酶，包括线粒体电子传递链中的酶、黄嘌呤氧化酶、环氧化酶、脂氧化酶、髓过氧化物酶、细胞色素 P450 单加氧酶、解偶联 NOS、血红素加氧酶、过氧化物酶和 NAD(P)H 氧化酶，都能产生 ROS。...ROS：H2O2检测试剂：HKPerox-1，HKPerox-2H2O2 主要由 NADPH 氧化酶与超氧化物歧化酶、线粒体电子传递链和许多其他酶共同产生，是一种强双电子氧化剂，但其高活化能限制了其对少数生物靶标的反应性...它与谷胱甘肽、半胱氨酸和蛋氨酸的反应非常缓慢，但根据特定的蛋白质结构和环境，其对特定蛋白质中半胱氨酸的反应活性可大大提高到 10 M-1S-1 (约为蛋白质中平均半胱氨酸的 106 倍)，为 H2O2 ...它的寿命很短，大约 10-9 秒，可以与许多生物分子如 DNA 碱基、脂质和蛋白质以扩散控制的速率发生反应，它的过量产生会导致细胞损伤，并与多种疾病有关。...ONOO- 通过触发一系列分子级联反应，在介导凋亡细胞死亡、炎症、梗死扩大和血脑屏障破坏中发挥关键作用。图 7.

    97122

    【辰辉创聚生物】重组蛋白AVI标签技术详解：生物素化策略与亲和纯化应用

    一是体外生物素化，即在纯化之前将表达获得的AVI标签蛋白与BirA酶、生物素及ATP等辅酶混合，通过优化缓冲体系和反应条件完成修饰。...二是体内生物素化，即在表达宿主细胞中共表达BirA酶，使蛋白在翻译过程中或翻译后自动被标记。无论采用哪种方式，生物素化反应的效率评估通常采用质谱、亲和检测或功能验证等手段。...在选择试剂和优化实验流程时，科研人员需要关注生物素化效率、反应条件兼容性和结合稳定性等技术要点。...体外生物素化反应受缓冲体系、pH、温度和辅酶浓度等因素影响，而体内生物素化则依赖宿主细胞的表达能力、BirA酶活性和分子伴侣系统。...从AVI标签表达载体、BirA酶及其辅酶体系、生物素及其衍生物，到链霉亲和素介质、链霉亲和素标记的检测试剂，这一系列科研试剂组合为蛋白纯化和分析实验提供了标准化、可重复的解决方案。

    26010

    TUNEL 检测细胞凋亡(附视频)

    本教材通过 TUNEL 法检测细胞凋亡， TUNEL，为原位末端转移酶标记技术。...其原理是：先增加细胞膜通透性，让 rTDT 和荧光素生物素标记的 dUTP 进入细胞内，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的辅助下将脱氧核糖核苷酸和荧光素等形成 的衍生物标记到 DNA 的 3’ 末端，从而可进行凋亡细胞的检测...如：0.2% TritonX 100， TUNEL检测试剂盒（包含 10×TdT 酶浓缩液、荧光素标记的 1×dUTP、转化剂POD），DAB 试剂盒， 3%过氧化氢甲醇，磷酸缓冲液 PBS 等。...TUNEL 反应 按照试剂盒说明书根据实验实际用量配制好标记反应体系。实验组和阳性对照组滴加 50μl 标记反应混合物，阴性对照组滴加 50μl 标记溶液，避光孵育30min。...TUNEL实验是会有一定的非特异性染色，我们可以通过去除内源性酶的干扰，增加洗涤次数，调节封闭和反应时间，镜下严格控制DAB染色程度来降低非特异性染色，注意在实验过程中，勿让切片干涸。

    2.8K42

    常用分子生物学实验技术–整理「建议收藏」

    一次试验中可同时检测几百甚至几千种目标蛋白或多肽。 　　　　（3）免疫印迹技术 Western blotting：利用抗原抗体特异反应的原理。 　　　　　　　　...聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种由引物（primer）介导，利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。 　　1....反应体系：模板DNA、耐热DNA聚合酶、两种引物、四种dNTP、含有Mg2+的缓冲液。 　　2. 反应过程：一般由25~35轮循环构成，每轮循环包括三个反应步骤。 　　　　（1）变性。...将反应体系温度升高到72摄氏度，此时DNA聚合酶将以单链DNA为模板，将单核苷酸逐个添加到引物的3`端，使新链不断延长，直至合成结束。 　　3....PCR产物的检测：PCR完成后，需要进行严格的检测分析，以确定是否得到了预期产物。常用的检测方法如下： 　　　　凝胶电泳、酶谱分析法、序列测定分析、核酸分子杂交。

    3.2K13

    3分钟理清细胞状态检测！Elabscience一站式解决方案来了

    ）低毒性，高活力，高增殖药物无效，癌细胞快速增殖细胞活力测定方法一览检测方法适用仪器核心原理检测时间特点ATP法多功能酶标仪（具备化学发光检测功能）基于荧光素-荧光素酶体系，检测活细胞内 ATP 含量，...产品检测原理：利用荧光素酶与ATP、荧光素的特异性酶促发光反应，且发光强度与 ATP 浓度呈严格的线性正相关，结合活细胞内的ATP含量与细胞活力的正比关系，实现对活细胞ATP的精准定量。...荧光素酶报告基因法化学发光检测仪 / 多功能酶标仪萤火虫荧光素被细胞膜破碎释放的萤火虫荧光素酶催化氧化生成氧化荧光素并发出黄绿色光。25 min高灵敏度，但需要构建报告基因体系。...产品检测原理：乳酸脱氢酶催化乳酸和NAD+反应产生丙酮酸和NADH，NADH在PMS作用下，将电子传递给WST-8，产生黄色的产物，其在450 nm有特征吸收峰，从而可以通过比色法来定量乳酸脱氢酶的活性...EdU 荧光法多功能酶标仪（具备化学发光检测功能）/流式细胞仪EdU 掺入增殖细胞新合成的 DNA 中，通过点击化学反应使荧光染料与 EdU 结合，荧光信号反映增殖活性。

    18310

    EST综述：eDNA的多种状态以及在水环境中持久性的认知

    化学反应包括光化学氧化、非生物水解和酶介导的水解 (称之为生物降解，因为这些酶是由活的生物体产生的)。...酶促反应和非生物反应都会导致DNA主干中酯键的水解裂解，并导致较长的DNA分子转化为较短的分子。 DNA分子的物理剪切也是一种潜在的机制，但这些力量在自然水生系统中不太可能。...大多数检测(n = 136)采用定量PCR检测线粒体基因(69.9%)。 技术重复，反应量，模板DNA量，和一个内部阳性对照，来测试抑制效应，确定检出限。...化学反应导致的DNA衰减 水解反应 DNA水解衰变可以由非生物和酶介导，并受环境因素(如水的pH值，温度和离子强度)的影响。 DNA链通过所谓的DNA酶开始酶解。...链间交联使得DNA无法被PCR检测，但这不是降解本身。 我们提到这个反应，是因为此时我们无法区分真正降解导致的未被检测与使用PCR出现的链间交联。

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