实际上， 这个方法还是过于粗糙了，肿瘤微环境的复杂程度，远不止基质和免疫细胞简单的归类。我随手查了一个比较新的综述文章：《Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance》，链接是https://biosignaling.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12964-020-0530-4，感兴趣的可以自己研读：
上期展示了ESITMATE（基于转录组数据）计算免疫得分和肿瘤纯度的一个例子，详见ggplot2实现分半小提琴图绘制基因表达谱和免疫得分。实际上计算肿瘤纯度的方法还有InfiniumPurify(基于甲基化数据)、ABSOLUTE（基于体细胞拷贝数变异）、PurityEst（基于突变数据）等等，而计算免疫浸润的有Cibersort、ssGSEA、TIMER等算法。
免疫治疗是如何工作的呢？其主要通过激活人体本身的免疫系统，依靠自身的免疫机能杀灭癌细胞。目前已在多种肿瘤如黑色素瘤，非小细胞肺癌、肾癌和前列腺癌等实体瘤的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，多个肿瘤免疫治疗药物已经获得美国FDA批准临床应用。
肿瘤免疫浸润分析是一个文献中的网红分析内容，分析软件有很多，本次先介绍一下cibersort ，xCELL 和 ESTIMATE ，这几款软件在文章中的出镜率都很高 。
在进行CIBERSORT分析的时候，关键的一步是根据内置的22种免疫细胞基因表达特征数据结合自己的表达矩阵文件计算每一个样本中的免疫细胞浸润情况。
To investigate the immune infiltration landscape of bladder cancer, ssGSEA was performed to assess the level of immune infiltration (recorded as ssGSEA score) in a sample according to the expression levels of immune cell-specific marker genes. Marker genes for most immune cell types were obtained from the article published by Bindea et al (16). Marker genes for M1 macrophages, M2 macrophages, myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and Tregs were obtained from published studies (10,14,17–25). The ssGSEA analysis was performed based on GenePattern environment (26). To run ssGSEA online analysis (https://cloud.genepattern.org), gene expression dataset file (GCT file), immune marker gene set file (GMT file), and other parameters were uploaded as a set. Finally, the ssGSEA scores, representing infiltration levels of immune cells for individual samples, were presented in the output file.
不管是哪种表达矩阵得到的差异分子，以前的mRNA的基因名，或者miRNA，lncRNA，甚至circRNA的ID ，看起来很陌生的ID，都是同样的的分析流程。
文章来源："Preoperative immune landscape predisposes adverse outcomes in hepatocellular carcinoma patients with liver transplantation" (2021,npj Precision Oncology)，数据与代码全部公开在https://github.com/sangho1130/KOR_HCC。
CIBERSORT采用去卷积的算法，基于转录组数据，在混合的细胞中估算出免疫细胞的组成和丰度。
首先有一些背景知识需要了解（特别是一些算法），但是我的理解方法特别粗暴，不知道Jimmy老师会不会打我。当然了，如果是原始的CIBERSORT R脚本 https://rdrr.io/github/singha53/amritr/src/R/supportFunc_cibersort.R 其实懂得使用即可。
最近听说定量免疫浸润很火，于是我也报名参加了果子老师的课程，跑了几个R包，你比如说xCell啊，GSVA啊，MCPcounter啊，ConsensusTME，ImmuneSubtypeClassifier，当然还有大名鼎鼎的CIBERSORT。安装R包跑实例文件这件事是我经常做的，但是很少做的这么系统。相比于跑R包，对我的更大难点在于理解定量免疫浸润这件事。
在之前的推文中我们介绍了2行代码实现9种免疫浸润方法，今天给大家介绍下常见的免疫浸润结果的可视化。
都是依据肿瘤病人的转录组测序表达量矩阵进行的分析，也有几百篇类似的数据挖掘文章了，它们总是喜欢落脚到estimate或者CIBERSORT结果的预后意义。
CIBERSORT 是基于线性支持向量回归（linear support vector regression）的原理对人类白细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的一个网页版工具。多用于芯片表达矩阵，对未知混合物和含有相近的细胞类型的表达矩阵的去卷积分析优于其他方法 (LLSR,LLSR,PERT,RLR,MMAD,DSA) 。该方法仍然是基于已知参考集，提供了22种白细胞亚型的基因表达特征集—LM22. 网址链接：http://cibersort.stanford.edu/
免疫浸润一直是生信数据挖掘的重点，免疫浸润的各种算法也是大家学习生信数据挖掘必学的知识点。
今天解读的这篇文章发表在PLoS Medicine（最新影响因子11.048）上，题目为Patterns of Immune Infiltration in Breast Cancer and Their Clinical Implications: A Gene-Expression-Based Retrospective Study。虽然发表在2016年，但是这篇文章在免疫方面的研究十分细致和深入，很值得大家学习和借鉴。
因为表达矩阵通常是bulk转录组测序，也就是说本来就是肿瘤细胞以及其肿瘤微环境的各种其他细胞组合而成，同理我们应该是可以根据表达量推断出来他们的细胞组分，当然，这个就需要算法上面的突破啦，下面我们就介绍一些相关方向的进展。
生物信息数据分析教程视频——13-3种R包(DESeq2、edgeR和limma)进行RNAseq的差异表达分析与比较
肿瘤不是单纯的恶性细胞群，而是由不同类型细胞组成的复杂生态系统。在这些细胞中，肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤控制和治疗反应中起着核心作用。例如，细胞毒性CD8 + T细胞是抗癌免疫的主要效应因子，因为它们可以特异性地识别和杀死携带新抗原的肿瘤细胞。肿瘤特异性抗原主要来源于突变基因的表达。但免疫细胞也可以发挥免疫抑制作用，支持肿瘤发生和免疫逃避，如调节性T细胞。
对于基于转录组数据来评价样本当中的免疫细胞浸润情况的算法已经开发出了很多种了。之前我们在介绍TIMER2.0以及这两个免疫浸润数据库的时候，也提到了很多中算法。例如GEPIA2021就是基于CIBERSORT, EPIC, quanTIseq这三种算法来进行评价了。
都是依据肿瘤病人的转录组测序表达量矩阵进行的分析，也有几百篇类似的数据挖掘文章了，它们总是喜欢落脚到estimate或者CIBERSORT结果的预后意义。但是实际上我们也代码演示了：estimate或者CIBERSORT结果真的是很好的临床预后指标吗，这样做风险很大，后面留了一个思考题，就是CIBERSORT的22种免疫细胞比例的生存意义的全部癌症的探索，呼应我们的主题《泛癌水平的批量生存分析》。
（2）基于此，使用CIBERSORT算法去预测TCGA每个样本的细胞类型组成比例。
CIBERSORT should enable large-scale analysis of RNA mixtures for cellular biomarkers and therapeutic targets (http://cibersort.stanford.edu/).
今天分享的是2020年4月份发表于Cancers的一篇文章，影响因子6.162。标题是Pan-Cancer Analysis of Radiotherapy Benefits and Immune Infiltration in Multiple Human Cancers。文章是针对多癌种对化疗获益的分析，主要是从免疫浸润差异入手来进行研究。最后集中在对BRCA数据集的分析，获得了3个化疗相关特征基因，并用ROC曲线对其诊断价值进行评价。
今天分享一篇发表于Cancer Immunol Immun，影响因子为4.9的文献。标题是Immune cell infiltration as a biomarker for the diagnosis and prognosis of stage I–III colon cancer. 文章利用CIBERSORT进行免疫细胞比例的计算，据此进行诊断模型和预后模型的构建和评估，并进行了基因富集分析用于生物学功能的阐明；
今天和大家分享的是2020年3月发表在Journal of Cancer（IF：3.182）上的一篇文章，“The immune infiltration in clear cell Renal Cell Carcinoma and their clinical implications: A study based on TCGA and GEO databases”，作者使用GEO和TCGA数据集研究了肾透明细胞癌中免疫浸润细胞的情况，并与正常组织进行了对比，通过生存分析研究了其临床意义。
肿瘤微环境在肿瘤进化和免疫治疗中起着关键作用。今天我们将以DNA甲基化数据作为切入点，通过CIBERSORT的去卷积方法来评估细胞浸润，将肿瘤样本分为免疫hot和免疫cold的亚组,并联合基因组和转录组数据进行验证和挖掘。
The immune infiltration in clear cell Renal Cell Carcinoma and their clinical implications: A study based on TCGA and GEO databases肾透明细胞癌的免疫浸润及其临床意义：一项基于TCGA和GEO数据库的研究
导管腺癌及其亚型是最常见的胰腺肿瘤，占胰腺肿瘤的85%～90%。大多数发展中国家的发病率为1～10人/万。由于胰腺癌的生存率极低，发病率和死亡率几乎是相等的。肿瘤免疫细胞浸润是指免疫细胞从血液中移向肿瘤组织，开始发挥它的作用。肿瘤中免疫细胞的浸润与临床结果密切相关，肿瘤中浸润的免疫细胞最有可能作为药物靶标来提高患者的生存率。
肿瘤免疫微环境我们讲了很多内容了，主要是 ESTIMATE 算法和CIBERSORT算法 ，目录是：
但是接下来大家又想问，同样的想比较两个分组的免疫评分的差异，但是免疫评分的工具太多了，比如有一个2019的综述文章：《Comprehensive evaluation of transcriptome-based cell-type quantification methods for immuno-oncology》比较了常见的免疫细胞比例推断工具的表现，另外一个2018的综述《Quantifying tumor-infiltrating immune cells from transcriptomics data》提到工具更多，起码十几款了。大家也不可能一一研读，下载，测试，使用它。但是又确实看到了大量数据挖掘文章都使用了这些免疫评分信息啊，比如：新鲜出炉（2021年6月）的文章：《Identification of a Ferroptosis- Related LncRNA Signature as a Novel Prognosis Model for Lung Adenocarcinoma》 ，就对比了 ESTIMATE, TIMER, MCP counter, CIBERSORTx,和ssGSEA ，如下所示：
点击进入，页面的最下方就是immunedeconv包下载的源代码，这是调用remote包中的install.github()函数进行下载。
生存分析是非常常见的表型分析。与生存分析相比，相关性分析是另外一个常见的表型分析。相关性包括表达与病理分期、治疗手段、年龄、种族、吸烟、突变、性别、共表达等因素的相关情况，通常用相关系数R表示，其差异也是用p值判断。
导读：解析肿瘤微环境的方法非常多种，包括CIBERSORT, TIMER, MCPcounter，xCell, ssGSEA, PCA等等，gene signature 也在不断的产生；但是你研究多年的基因是否与肿瘤微环境相关，除了机制实验来证明，还可以通过大量的数据库资料来证明与可视化。
最近有粉丝提到是否可以把多个样本混杂到一起建立一个10X单细胞转录组库进行测序后数据分析，的确是有这样的例子，比如我前些天在Twitter看到的发表在Nephrology Dialysis Transplantation, 的文章, https://doi.org/10.1093/ndt/gfz227 题目是：A single-cell map for the transcriptomic signatures of peripheral blood mononuclear cells in end-stage renal disease 就是这样。
作者首先对TCGA的转录组数据进行评估，使用CIBERSORT在22个免疫细胞表型中筛选与预后相关的5种免疫细胞。再对两组独立的标本进行5种细胞的免疫组化，构建免疫表型，预测MIBC患者的生存和复发。
WGCNA （weighted gene co-expression network analysis）权重基因共表达网络分析（流程模块见下图），可将表达模式相似的基因进行聚类，并分析模块与特定性状或表型之间的关联，常用于筛选关键表型的hub基因 ，是RNAseq分析中的一块很重要的拼图。而之所以叫组学数据黏合剂是因为表型可以是患者的临床信息（生存信息，分期信息，基线信息等），可以是重测序信息肿瘤（驱动基因的变异与否，signature ，CNV信息等），可以是转录组结果（免疫浸润，risk score ，GSVA ，分子分型结果），可以是单细胞数据（celltype ，AUCell 打分）等等 。注：这些在公众号之前的文章中大多都有涉及，文末有部分链接。
详见kegg数据库的官网 ：https://www.genome.jp/kegg/pathway.html
细胞焦亡在胃癌的进展中起着至关重要的作用，并影响胃癌的预后。然而，细胞焦亡相关lncRNA在预测胃癌预后方面的重要性尚不清楚。
近年来，免疫检查点阻断(ICB)在多种恶性肿瘤的治疗中取得了成功。然而，由于患者之间免疫治疗的异质性的存在，仍需要研究宿主-肿瘤的相互作用，特别是肿瘤微环境(TME)内的免疫细胞浸润，来确定可靠的精准治疗预测生物标志物。
肿瘤免疫疗法在多种恶性肿瘤的临床治疗上取得了显著效果，然而还是存在大部分患者对于免疫疗法没有响应的问题。为了更好的理解肿瘤和免疫细胞相互作用，科学家对来自TCGA和其他几个大型肿瘤研究项目，共20种实体瘤的NGS数据进行分析。TCIA研究发表在Cell Rep（1区，IF9.423分）上：
大家好，今天小编分享的是今年3月份发表在Diagnostics (Basel)(IF：3.1)的一篇非肿瘤纯生信文章，本文作者通过挖掘GEO数据库中骨关节炎相关数据集，经差异分析，用LASSO回归和支持向量机法构建预测模型筛选出标志分子，此外还分析了OA中的免疫细胞浸润情况。文章思路简单，快来学习吧！
目前，越来越多的研究者通过构建小鼠疾病或者癌症模型，研究癌症发病机制。因此，对小鼠免疫微环境分析需求越来越多。所有检测不同细胞类型所占比例的方法主要原理是，构建特征基因集，然后利用机器学习方法或者反卷积方法对所测RNA-seq数据进行分析，确定其不同细胞类型比例，因此这种方法也对阈值选择比较敏感。
根据我们的整理，差异分析是基础，生存分析和相关性分析是表型，免疫浸润分析是对表型的阐释，兼有表型和机制两种作用，但并不是真正意义上的机制探究。通常意义上的机制一般涉及信号通路，是一系列分子的级联反应。
肿瘤免疫疗法在多种恶性肿瘤的临床治疗上取得了显著效果，然而还是存在大部分患者对于免疫疗法没有响应的问题。为了更好的理解肿瘤和免疫细胞相互作用，科学家对来自TCGA和其他几个大型肿瘤研究项目，共20种实体瘤的NGS数据进行分析，对应文章链接如下
Profiles of immune infiltration in colorectal cancer and theirclinical significant: A gene expression- based study
胰腺癌是世界上预后最差的恶性肿瘤之一。铁死亡作为一种新的程序性细胞死亡，已被证明在肿瘤治疗中具有潜力。
前面介绍了通过 RNAseq｜oncoPredict 药物反应预测，+基因，+分型，+模型 的联合可视化 预测患者对 小分子药物的反应。那如果预测当前临床治疗上常用的免疫疗法（PD1， PD-L1 ，CTLA4）反应呢？
alona是一个基于网络的生物信息学服务，旨在分析单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据。该服务使用一些最流行的scRNA-seq算法执行处理、分析和可视化。使用来自PanglaoDB的标记基因将细胞注释成细胞类型。用户也可以提供自己的标记基因，而不是使用默认的标记基因。处理后的数据可以通过基于JavaScript的直观web界面进行探索。
外泌体(30~150nm大小)是活细胞分泌的最小类型的细胞外囊泡(∼为30~1000nm)，通过所有体液的循环系统，如血液、尿液和眼泪，作为细胞间的信使。体液外泌体的来源混杂，可以是任何组织和细胞分泌的外泌体然后经体液循环进入。
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