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illumina是当前最热门的二代测序公司，它的测序特点是使用具有叠氮基和荧光标记的dNTP边合成边测序。
欢迎大家打开本次推送~从本期推送开始，将由 ? 小编为大家整理《陈巍学基因》的笔记。 《陈巍学基因》是一系列由陈巍老师主讲的视频节目，从 15 年开始更新（视频所示部分技术并非文章发布时「2020
文章包括了从一代测序桑格测序到二代测序到三代测序的原理、流程以及发展历程，由浅入深
第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。我们都知道一代测序为合成终止测序，而二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序（Sequencing by Synthesis）。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代测序中，单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA序列；而随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，这严格限制了二代测序的读长（不超过500bp），因此，二代测序具有通量高、读长短的特点。二代测序适合扩增子测序（例如16S、18S、ITS的可变区），而基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法（Shotgun method）打断成小片段，测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。
目前主流三代测序平台除了Oxford 家的 Nanopore，还有 Pacific Biosciences（简称 PacBio）公司的 Single Molecule Real-Time（SMRT）Sequencing。 该平台的优势在于：
Illumina做为全球最大的二代测序仪生产商，成立于1998年，起家是芯片技术，2006年收购Solexa，开启了二代测序的霸主地位，占有至少七成的二代测序市场份额。今年Illumina将以大约12亿美元的价格收购Pacific Biosciences，扩大对长读长序列的访问并加速科学发现，在三代测序的积极布局也会带来新的市场突破和技术突破。华大继MGISEQ200/2000后，又推出了MGISEQ-T7，希望能在市场上争取更多的份额和应用。这部分也会更新在测序发展史：150年的风雨历程中。
1953年4月，Watson和Crick关于DNA双螺旋结构的文章发表于Nature，成为生物学研究的里程碑。此后，生命科学进入了DNA解密的时代。道德经所言“道生一，一生二，二生三，三生万物”，这“三生万物”需要的竟然仅仅是四种碱基的排列组合。生命的秘密藏在DNA序列中，首要任务，便是测出这序列内容。1970年，吴瑞先生建立了位置特异性引物延伸的测序方法，开了DNA测序技术的先河。随后在1975年，Sanger建立了自己的测序方法。1977年Gilbert等人建立了化学降解法，同年，Sanger改进了之前的方法，确立了日后第一代测序的主流方法：Sanger测序法。
目前测序技术以第二代技术为主，有许多公司均开发出了自己公司的测序技术，经过不断竞争，Illumina平台成为目前的第二代技术测序主流平台，所以要了解第二代测序原理，可以以Illumina平台测序技术为重点进行了解
单细胞 RNA 测序（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上利用 RNA 测序对特细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。待测组织经过单细胞分离、RNA 提取、逆转录、文库构建和测序，便可利用数据分析获得多个细胞的基因表达谱。
illumina 测序最大的就是通量大，正是由于通量大，才可以做大价格低。由于其通量大且价格低，可以满足巨大部分测序的需要，因此，正式开启了高通量测序的时代。Illumina 测序有着非常广泛的应用，最早应用于基因组的组装，还可以用于变异检测，RNAseq，单细胞测序，产前筛查，肿瘤检测等。
由于三代 nanopore 测序质量比较低，原始数据中存在大量测序错误，即使拼接前进行了纠错，组装结果中仍会存在错误，用长读长或短读长的数据对组装结果进行矫正可以，提高准确率，减少 Miscalls，Indels，改善由错装（mis-assemblies)导致的低比对区域。因此，序列拼接完需要对拼接结果进行优化，根据文献报道，经过 polish 之后，拼接结果与真实基因组（其他测序数据拼接结果）的一致性可以达到 99.99%以上。即使组装工具带有纠错功能，仍建议再次进行一轮或多轮的矫正。
目前主流三代测序平台除了Oxford 家的 Nanopore，还有 Pacific Biosciences（简称 PacBio）公司的 Single Molecule Real-Time（SMRT）Sequencing。该平台的优势在于：
本着“三百六十行，行行转生信”的崇高宗旨，基础科研、生物学出身的小编在今年成功进入生信圈，入坑的时候才发现贵圈真的是太乱了，不仅要敲的了代码，跑的了数据，而且跨行不太成功的我还要怒扛鱼饲料、单刀斩鲤鱼。忽然想起了那天在夕阳下拉网的我，那是我逝去的青春（本人海洋生物专业的偶）。
所以理论归理论，最终要落实到分析代码上，咱们从这一篇开始，介绍一套扩增子数据分析流程。
测序知识 测序原理 文章《测序的世界》https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2 视频《Illumina Sequencing by Synthesis》https:
仅2018年，他的研究团队就发表了11篇单细胞测序方向文章，获得了单细胞测序领域的接连重要成果。他众多学术成果中，有40余篇论文发表在Cell, Nature, Science, Cell Stem Cell, Nature Genetics, Nature Cell Biology, Cell Research, Genome Research等期刊上。单细胞测序领域的时代前沿性，以及持续的发展力可见一斑。
原理介绍视频：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密码： 密码：bxsry4
6月13日，美国加州北部地区法院法官William Orrick批准了Illumina公司对华大基因的禁令。华大基因使用标准MPS测序和CoolMPS化学测序技术的基因测序仪，将被禁止在美国推广销售。这项禁令不包括华大基因的样品制备产品。
Illumina将以大约12亿美元的价格收购Pacific Biosciences，扩大对长读长序列测序并加速科学发现
前面我们了解了基因组拼接，今天给大家带来的是拼接原理。了解实验原理，就是为了我们更好地做实验。
摘自：基因空间 网站：www.qynode.com 基因测序行业格局已定 全球基因测序巨头Illumina公司最近公布了2014年的财报，让我们来看看这些振奋人心的数据：全年的收入增速为31%，毛利
蕾妮·瓦林特（Renee Valint）的女儿谢尔碧（Shelby）在2000年出生时，看起来虚弱无力，就如同一只耷拉着的布娃娃。谢尔碧学着走路和说话，但学得非常慢，错过了儿童发展的重要阶段。到4岁时，她还只能坐在轮椅上。到五年级时，她开始要用电子语音设备与人交流。绝望无助的蕾妮把女儿从菲尼克斯带到明尼苏达州罗切斯特的梅奥诊所（Mayo Clinic），进行最后一周的检查，并与美国最好的一些医生讨论病情。 “他们都把手一摊，说：‘我们不知道她出了什么问题。’”蕾妮说道，“那时，她已经动都动不了了。我给她洗澡
Cellranger mkfastq 管道可用于将 BCL 文件解码为单个库的 FASTQ 文件。如果测序提供程序已经完成了这一步，则可以直接使用每个库的 FASTQ 文件进行数据分析。cellranger mkfastq的本质是调用bcl2fastq生成bcl2fastq，并生成额外的10x样本信息。Bcl2fastq是 illumina开发的bcl到fastq的转换程序。cellranger下载安装地址如下：
大浪淘沙，好多基因测序仪厂家已经被历史的车轮甩在了滚滚红尘里，还余下几家大的公司屹立在市场上，有的正在垄断市场（Illumina），有的是正在急速掘起的翘楚(Oxford Nanopore, Pacbio)，还有的是国产的希望(华大智造)。今天，让我们来再看一下它们主流机器的参数，来对比下机器的性能。
三代测序错误率比较高，一般组装后需要进行纠错来提高准确度。本次介绍使用Pilon通过引入二代测序数据来对三代基因组进行纠错，此外Pilon还支持对二代测序数据拼接结果进行纠错。
第一行：以‘@’开头，是这一条 read 的名字，这个字符串是根据测序时的状态信息转换过来的，中间不会有空格，它是每一条 read 的唯一标识符，同一份 FASTQ 文件中不会重复出现，甚至不同的 FASTQ 文件里也不会有重复；
读长超长、速度快、准确性低、通量高、价格高、电信号、无GC偏向性、小的插入缺失错误、更新快
本教程主要针对16s这类文库，供参考使用。具体的操作流程还是以Illumina的官方文件为准。
外显子测序，也叫做外显子捕获测序。首先利用序列捕获技术将外显子区域的DNA捕获并富集，然后进行高通量测序。外显子测序主用用来分析基因组上的变异位点，包括SNP和INDEL。
虽然三代测序现在已经商用，但是目前的主流还是二代测序，尤其是Illumina公司的测序方式更是大行其道。那么，下面我们从四个方面来说说illumina家的二代测序是怎么得到的生物数据。
测序原理 我感觉这个讲得挺好的： 【中英双语】Illumina测序原理详解 | 边合成边测序 素材来源：YouTube官方 https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5
3.Centrifuge和Minimap2是处理纳米孔数据的最合适工具，并且可以认为它们是当前的最佳选择;
在中国两部委（食品药品监督管理局、国家卫生计生委）用一纸禁令将基因测序打入“冷宫”仅两个月，世界最大的基因测序仪器制造商Illumina的掌门人Jay Flatley先生就急冲冲跑来中国，并高调表示：“我十分看好中国基因测序市场。” 可能有人会怀疑Jay Flatley这一逆风言论，但没有人会怀疑Illumina在基因测序行业的霸主地位。这家总部位于美国加利福尼亚圣迭戈市的上市公司，被麻省理工学院主办的《技术评论》杂志评为全球最聪明的50家公司之首，其身后站着的可是特斯拉和谷歌。 这家全世界最聪明的公司
在前面介绍过不同测序平台的优势，目前市场上主流测序平台主要包括短读长测序的 illumina 测序平台，华大基因的 MGI 测序平台，长度长测序的 Pacbio 测序以及牛津纳米孔 nanopore 测序。在 ncbi 的 sra 数据库中，目前超过 95%的的数据均来自于 illumina 测序，这一方面是由于 illumina 发布较早，从 2007 年就开始，另一方面是由于短读长测序价格更低，更适合定量研究。目前基因表达差异分析主要还是应用短读长测序。
要想估计基因组的大小，也就是整条基因组的长度，我们把这个值设为大 G。那么测序的所有碱基数可以计算出来，将所有 reads 的碱基加起来就可以，为大 S。用所有碱基数除以每个碱基的平均覆盖深度 D，碱基总数除以测序深度，那么就可以得到基因组的长度了。所以，要想估计基因组大小，必须计算出每个位点被覆盖的平均深度，因为我们已经有了总碱基数S。但是这个深度无法直接计算出来，所以，我们通过 kmer 的深度，来推测测序的深度，进而求出基因组大小。那么就是要推测出 kmer 深度与测序深度之间的关系，下面我们来看一下如何通过 kmer 的深度来计算测序的深度。
我们拿到测序的原始数据后，其实并不是所有的都是能用的数据，我们需要先做质控与过滤。首先认识下碱基的指标Q20（百分之一出错率），质量值>=Q20：好碱基，质量值<Q20：坏碱基。不过现在基本都用的Q30(千分之一)、Q40(万分之一)。
Running Head: Illumina MiSeq Run Comparison Tool
在当前测序市场条件下，一代二代三代测序平台共存，这是因为每一个测序平台都不是完美的，都有优缺点，例如一代测序准确性高，读长长，但是相应的通量低，价格贵。二代测序显著特点是通量大，准确性高，价格便宜，但是读长短，而三代测序读长长，通量高，但是错误率高，这就需要我们能够根据每种数据的特点，充分利用每一种测序平台数据，得到最优的方案。例如当前基因组拼接中，尤其对于一些大型的基因组，往往混合多种测序平台数据进行拼接，达到最佳的拼接效果。
前面给大家简单的介绍了什么是免疫组库。今天小编给大家介绍一种研究免疫组库的方法。
Bwa 0.7 版本和GATK 3.4将fastq文件碱基比对至hg19（GRCh37）人类参考基因组上生成bam文件，并根据基因组坐标对bam文件进行排序，然后对基因组复杂区域进行序列比对优化。
该文章中对 20 个细菌基因组进行测序，每个样本分别进行了 illumina，pacbio 以及 nanopore测序。比较三种数据的拼接结果。其中两株细菌已包含发表出来的全基因组序列。
Sanger-双脱氧链终止法原理：设置4个反应体系，分别加入DNA、引物、酶、4种dNTP，和其中1种带有标记ddNTP。在加入ddATP反应体系中，当ddATP和T碱基结合，反应终止，在这个反应体系中，ddATP会结合DNA上所有T位点，其余3种反应体系同上。
相比二进制的 bcl2fastq2，基于 Perl 语言的 bcl2fastq-1.8.4 或许是从源码层面学习了解 Illumina 测序数据处理一个不错的选择。源码版本的 bcl2fastq-1.8.4.tar.bz2 目前没能安装成功，这是基于 bcl2fastq-1.8.4-Linux-x86_64.rpm 的一些折腾记录。
Sanger法是基于DNA合成反应的测序技术，又称为SBS法、末端终止法。1975年由Sanger提出，并于1977发表第一个完整的生物体基因组序列。
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