最近有很多同学私聊小编说，刚进入实验室开始科研，但qPCR结果却总是不理想，实验一直停滞不前，非常的苦恼。记得我刚进实验室的时候，为了验证目标lncRNA在癌和癌旁的组织中有没有差异，闷着头做了两个月的qPCR。那么什么是qPCR呢，为什么有的同学结果总是不理想呢？今天小编就带大家一起探讨一下~
著有 “玄学” 之称的分子生物学，师兄师姐说小 M 要做的都是 “升级打怪入门级” 的实验，然而，实验记录本上清晰地罗列着自己整理的堪称完美的 (假装看懂的 Steps) 实验流程，可是完美的流程下，总是充斥着不丝滑的操作——提 DNA，PCR，电泳，纯化回收，构载体；提 RNA，反转录，文库构建，qPCR……如何快速完成一套绝美的逆袭！！！
然而，各种PCR技术，包括PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR和dPCR，长得实在是太像了，好多同学看得头晕眼花也没弄明白这几种PCR有什么区别。
一般qPCR的结果都是机器自动生成的，配合机器自带的软件生成一个Bar图，然而这个Bar图，没有统计信息，更没有好看的配色。
转录组分析是一种用于研究细胞或组织中所有RNA分子的表达水平的高通量技术。完成转录组分析后，科学家们通常需要通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）来验证二代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）结果的可靠性。这是因为qRT-PCR是一种精确的定量方法，可以用来验证特定基因的表达水平。
一. RT-qPCR 基本原理和概念 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
WB蛋白样本准备中最常用的是热变性（95-100℃，5min） ，并在加用上样缓冲液（loading buffer）。 Loading buffer分还原型和非还原型，还原型loading buffer多加有β-巯基乙醇等还原剂，能抑制或者破坏二硫键等的形成，能够更好地维持蛋白质的一二级结构。
由于在短时间内还无法研发出冠状病毒特效药或疫苗，所以就全靠人类自身的免疫力（抗体细胞）来对抗冠状病毒。不过这些抗体细胞需要外部助力才行。因此，现在对抗冠状病毒的主要手段（不包括口罩，口罩不算设备）就是检测和辅助呼吸。对抗冠状病毒的第一步需要尽可能多，尽可能快地找出被感染的人，这就需要大量的检测设备，如果已经确诊，就需要考病人自己的免疫力来对抗冠状病毒了，不过在对抗冠状病毒的过程中，由于肺部细胞被冠状病毒攻击，病人可能在一定时间内部分或全部丧失呼吸能力，所以就需要辅助呼吸设备，也就是我们常说的呼吸机。因此，现在世界各国争夺的也就这两类设备：冠状病毒检测设备和呼吸机。所以本文将就这两类设备给出一些开源的解决方案，也许这些解决方案会成为那些医疗资源不足的机构和国家的新大陆。
最近几年来m6A研究迅速发展，正是得益于meRIP-seq技术的开发及应用。meRIP-seq高通量测序技术的出现，能够高效精确检测全转录组不同的RNA 甲基化，是成功发现RNA 甲基化机理及功能的关键技术。MeRIP-seq 技术将甲基化DNA 免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation， MeDIP) 技术、RNA 结合蛋白免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)技术和RNA 测序(RNA sequencing，RNA-seq) 技术组合起来，高精度地检测全基因组(或全转录组)范围内的RNA 甲基化。MeRIP-seq 技术采用免疫共沉淀方法，即甲基化RNA 特异性抗体与被随机打断的RNA 片段进行孵育，抓取有甲基化修饰的片段进行测序(IP),同时需要平行测序一个对照(Input)样本，对照样本用于消除抓取带有甲基化片段过程中的背景。然后将免疫共沉淀(IP)样本和对照样本中的序列片段对比(或定位)到参考基因组/ 转录组上，检测RNA 甲基化位点。对照样本测量对应RNA 的表达量，本质上是RNA-seq 数据。
表达量芯片差异分析阈值：a false discovery rate (Benjamini–Hochberg test) adjusted p value of ≤ 0.05 and absolute fold-change values ≥ 2 or ≤ 0.5. （其中 3,248 were upregulated while the other 1,881 genes were downregulated ）
Real-time Quantitative PCR Detecting System，简称qPCR，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，是目前较为先进的核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇。
临床样品的特色是：通常是FFPE样本，在保存过程中往往造成RNA的断裂，不论是qPCR还是RNA-seq都难以进行精准的定量，这个时候Nanostring 仪器就是为了解决这些问题而诞生的。所以它在医院的流行程度很高，而我们要介绍的这篇文章就来自于医院科研人员，所以选择Nanostring就很容易理解啦。
PCR可以算得上是各生物实验室的标配技术了。无论是基因定量、克隆、组装、突变、测序……都离不开基于PCR的实验。目前，PCR相关试剂、耗材及仪器已经发展得相当成熟，包括聚合酶以及缓冲液的优化，使得扩增能力、保真度和兼容性均得到极大的提高。因此我们不再需要像过去一样，分散部分注意力用于摸索热循环条件、调整反应体系各底物的浓度等。也就是说，整个PCR实验条件，基本可以模板化，而不需每做一个实验都从头开始摸条件。 然而PCR实验中，有一个环节是厂家无法帮我们优化的，那便是引物设计。本文第一部分将以人EGFR基因为
---- 新智元报道 编辑：拉燕 时光 【新智元导读】香港这波疫情爆发，仓鼠也在其中添乱搞鬼？看看顶会「柳叶刀」上的专家怎么说。 香港疫情爆发的罪魁祸首之一，竟然是下面这个萌萌哒的小动物？ 仓鼠带给人们欢乐、慰藉、陪伴，以及...... 新冠病毒！ 3月12日，医学顶级期刊「柳叶刀」上的一篇名为「案例研究：SARS-CoV-2型delta变异病毒（AY.127）从宠物仓鼠传播到人，引发人际传播」的论文引发热议。 这项研究由香港大学公共卫生学院严慧玲博士领衔，此外还有十多位研究人员合作完成。
MCE RT Master Mix for qPCR 含有反转录反应所需的所有组分，只需加入 RNA 模板和 H2O 即可快速高效完成反转录反应，反转录产物 cDNA 可直接用于 qPCR。
文章主要对一块实验土壤做了温度、降水、剪草等处理，测了细菌、真菌、原生生物的多样性以及生物和非生物的环境因子，最后发现增温通过影响土壤湿度改变了细菌的多样性，进而影响了原生生物。最后与宏观生态进行了关联，升华到了全球变暖问题如何一步步导致了微生物的多样性降低。
兼容性好：与 MCE SYBR Green qPCR Master Mix (HY-K0501、HY-K0521、HY-K0522、HY-K0523) 配合使用即可进行高性能的基因表达分析。
ceRNA（竞争性内源RNA）是近几年的研究热点，已知microRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而ceRNA可以通过竞争性地结合microRNA来调节基因表达。ceRNA（最常见的为lncRNA和circRNA）可以通过应答元件（microRNA response elements, MREs)与microRNA结合从而影响microRNA导致的基因沉默。相较于microRNA调控网络，ceRNA作为一种全新的基因表达调控模式，其更为精细和复杂，涉及更多的RNA分子。
一、实验方案设计 二、高分文献解析 三、分子生物学技术 四、细胞生物学技术 五、转录组、代谢组、蛋白组测序 六、生物医学实验方法PDF汇总
本文总结了目前关于芳香族化合物环羟基化加氧酶基因的数据库,介绍了微生物降解芳香族化合物(苯系物、萘及其它多环芳烃)过程中发挥重要作用的各类功能基因,总结了环境检测中使用的分子引物,并综述了它们在各类复杂环境样本中的检测应用,此外对使用宏基因组技术来研究微生物在环境中降解芳香族化合物的能力进行了总结与展望.
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一项利用 DNA 双链复制原理，在生物体外复制特定 DNA 片段的的核酸合成技术。可在短时间内大量扩增目的 DNA 片段，而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。
1986 年，Mullis 发明了 PCR 技术，当时使用的是大肠杆菌聚合酶 I（Klenow），而这个酶是不耐热的，在反应体系温度升高使 DNA 变性的过程中会失去活性，因而每次循环都要加入新的聚合酶，操作十分麻烦，不能做到无人值守，成本也很高。
这篇论文是生信技能+湿实验验证的套路，湿实验只有RT-qPCR和免疫组化分析（IHC）。文章题目是并列句，是生信分析的预后和诊断价值+肿瘤免疫微环境这个研究热点的结合。
反转录PCR（Reverse Transcription，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
由安吉莉娜·茱莉助推的基因检测仍在持续火热，蓝海逐步成为红海。而早就有人把目光投向了肠道微生物群的检测，最近一段时间ncs的接力发表足以说明它的火热，检测公司国外有ubiome等，国内也有多家公司进行这个检测。下面，我们来管中窥豹，看看几个检测方法的比较，只说我用搜索引擎找到的公司，无任何偏好性。
3、依靠这样的公式，我们可以很轻松的提出国家自然科学基金的科学假说，也能屡清楚课题中的关键点。
PS：如果你的转录组实验分析报告没有这三张图，就把我们生信技能树的这篇教程甩在他脸上，让他瞧瞧，学习下转录组数据分析。
最近刷文献，发表在 October 7, 2019的PNAS的：Immune effector monocyte–neutrophil cooperation induced by the primary tumor prevents metastatic progression of breast cancer 粗略的看完了全文才发现里面居然是有单细胞转录组的。但是搜索全文，才出现5次single这个单词。 这篇文章的测序数据是公布的：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/qu
❝好些年之前写过基因家族分析的文档，今年恰逢有朋友有这方面的需求于是小编重新整理了一下「基因家族分析的图表」,以往大家均是使用软件来进行基因家族的数据分析及可视化，随着小编代码水平的提高这次所展示的所有图表均由「ggplot2」及其扩展包组合完成，通过这种方式做的基因家族文章可以完全称得上生物信息，当然本教程的重点已经不再是基因家族分析了，而是深入的使用R语言来进行数据分析，关于「教程后续会出介绍内容，尽情期待」,下面来放部分结果给大家参考 📷 ❝基因家族类的文章主要以短平快为主，且不耗费经费实在物美价廉
五月份看了一篇2016年的RNA-Seq文献综述，那篇文献特别长，花了三四天时间才看完。当时为了做组会文献报告做了一些许总结，以ppt的形式呈现出来。 内容 前言 各位同学/老师，大家好，现在由我给大家讲讲我的文献阅读报告！ A survey of best practices for RNA-seq data analysis ,我把它叫做RNA-seq数据分析指南。这篇文章是由佛罗里达大学等单位的研究人员在1月26日发表在Genome Biology上的，该期刊的影响因子有10.8分。这是这篇文章的通讯
有非常多的文献报导指出，lncRNA可以作为miRNA sponge， 从而与miRNA发生相互作用。LncBase是一个专门记录lncRNA与miRNA相互作用的数据库，最新版本为v2, 网址如下
之前写的RNA-seq数据差异表达分析一文中提到，筛选得到差异表达基因list后，需要进一步分析这些基因参与了哪些功能，因此要进行后续的一些分析，比如功能富集分析、聚类分析和基因共表达网络分析。这次主要介绍在线功能富集分析与qPCR引物设计。其中在线功能富集分析可利用本人所在课题组开发的agriGO和PlantGSEA在线分析工具，分别进行GO富集分析和基因集富集分析。
荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模版的量。实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。
DNA/RNA测序的最新进展实现了通过“精确”定位个性化疾病模块来快速识别新靶标并重新利用已批准的药物治疗异质性疾病。基因组学时代，药物开发已成为高度集成的系统性问题，互补多组学与计算方法成为新的研究范式，由于基因组学和系统生物学最新技术和计算方式的进步，使得利用导致人类疾病的癌症类型特异性机制来识别新靶向药物与治疗药物成为可能。基于网络的方法通过度量药物靶标与人类蛋白相互作用组中疾病蛋白的接近度，为药物重新定位靶标和联合疗法提供了可能性。
嵌合型UPD可用WES, High-Coverage WGS 📷 非嵌合型UPD/IBD,可用WES, Medium-Coverage WGS, High-Coverage WGS 📷 50bp-1kb 的极小CNV，可用WES, High-Coverage WGS，用基于splice-alignment reads、discordant read pair 、local assembly contig等信号的SV caller来分析 单基因/外显子级别的CNV(可用WES, High-Covera
说起Real-Time PCR，大家都不陌生，毕竟是检测基因转录水平表达情况最基本的实验了。但是对于没有接触过的小伙伴来说，还是挺陌生的，所需试剂仪器就先不聊了，今天小编单就lncRNA/mRNA引物设计来说道说道。
工具入口：www.chrislifescience.club:3838/R/AnnoE2
近些年来，过去被视作冗余垃圾的Noncoding RNAs被发现在基因表达调控中发挥了重要作用
MPRrimerW2支持九个物种的引物设计网站。我们可以通过输入基因名/fasta序列格式来设计引物的数据库。
数据分析文章：scRNA分析重症COVID-19患者多个样本，得到一种单核细胞衍生的肺泡巨噬细胞 (MoAMs) 亚型，并且FCGR3B基因在其中特异性表达，提供了一个新的biomarker。
病毒属于无细胞生物，无法独立生存，都是营寄生生活，寄生在宿主细胞内。新冠病毒感染之后，病毒寄生在人体细胞内。目前的技术条件下无法对病毒进行分离培养。由于新冠病毒为单链 RNA 病毒，在提取过程中得到是 RNA 产物，最终得到的 RNA 样本其实属于一个混合样本，是宿主与病毒的混合样本。由于人基因组大小约为 30 亿个碱基对，而新冠病毒基因组大小约为 3 万个碱基，二者长度相差 10 万倍，因此，提取到的染色体中人基因组占据绝大部分。因此对于新冠病毒染色体提取过程中最重要的步骤就是如何对病毒进行富集，目前只能通过 PCR 扩增富集的方法，或者是宏基因组的方法将混合物直接进行测序，在 NCBI 下载新冠病毒测序数据的时候描述部分会有 metagenomics 或者 Amplicon ，分别表示利用宏基因组测序还是 PCR 扩增。下面我们分别进行介绍。
小编这次要分享的两篇高分文献，是今年5月发表在Gut和Mol Cancer杂志的两篇文章，一个研究胃癌一个研究胰腺癌，都是很经典的研究套路。今天小编就为大家深度剖析文章思路，特别是就如何找到关键问题：怎么找到受甲基化酶调控的靶基因？做了具体的展示。
研究者们首先通过流式预先把细胞分类，分成：basal/stem, luminal, and luminal progenitor cells这3群细胞，如下所示：
以往的研究表明，miR-144-3p可能是非小细胞肺癌（NSCLC）的潜在生物标志物。然而，miR-144-3p对NSCLC起源，分化和凋亡的影响以及miR-144-3p与临床参数之间关系的综合机制很少有报道。
1976年首次发现的具有完全闭环结构的RNA。然而，由于传统RNA检测方法的局限性，这些没有poly-A尾巴的转录本长期被忽视。近年来，随着高通量测序技术的发展，在真核转录组中发现了大量的circRNAs。circRNAs具有细胞类型特异性和跨物种高度保守的特点，被认为是在多种疾病中起重要作用的新的星形rna，包括人类癌症。
本文主要聚焦心内膜细胞在左心室发育不全中（HLHS）发挥的作用。对第83天正常胎儿心脏和第84天HLHS疾病的胎儿心脏来源的细胞、以及（病人、正常人来源的）iPSC进行诱导分化的细胞心内膜细胞进行单细胞测序分析，发现了心内膜细胞中在HLHS疾病中缺陷，HLHS来源的心内膜细胞会导致发生的EndoMT过程、血管形成功能受损。这些过程很可能在转录因子ETS以及CDH7的作用下完成。
这篇文章是2022年6月份发表在Science Advance上的文章，主要是讲的通过对地上的形态组织的极性基因进行研究，明确了其信号转导的作用。
摸索单细胞转录组数据分析这两年，我遇到过太多的CNS文章及综述，但只有本文被我安排给了所有人进行翻译，本译文来自于最优秀的学习者，最开始在不到3000粉丝的单细胞天地公众号发布，却喜获近5000的阅读量。
本期文章题目是：A Targetable EGFR-Dependent Tumor-Initiating Program in Breast Cancer
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