【Nature子刊】追随心脏的脉搏，中山大学周建华团队创新推出超快速hs-cTnI检测！

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作者：Tracy

导读：急性心肌梗死（AMI）因其高死亡率，而成为威胁生命安全的公共卫生疾病。典型心脏生物标志物，肌钙蛋白 I （cTnI） 的侧流检测 （LFA） ，对于及时预警AMI至关重要。由于色谱膜的性能有限，使用电流 LFA 实现 cTnI （hs-cTnI） 的超快速和高灵敏度检测，一直以来都是一项挑战。在本研究中，团队揭示了一种带刺箭头状结构膜（BAS Mem），它能够实现液体的单向、快速流动和低残留。BAS Mem上的液体流动系数为14.5（迄今为止最高）。

2024年7月3日，中山大学生物医学工程学院周建华团队在《Nature Communications》杂志发表了题为"Barbed arrow-like structure membrane with ultra-high rectification coefficient enables ultra-fast, highly-sensitive lateral-flow assay of cTnI"的研究论文，该团队使用BAS Mem代替传统的色谱膜，研制了一种侧流试纸，并在240秒内实现了cTnI的LFA，检测限值为1.97ng mL−1。侧流试纸在检测25份疑似AMI患者样本时，表现出100%的特异性，灵敏度为93.3%。

研究背景

01

急性心肌梗死（AMI），是一种危害人类生命的全球性心血管疾病。患者可能会在症状出现后数小时内迅速恶化，例如，胸痛和呼吸急促，这可能导致猝死。AMI的标志是心肌损伤，主要由心肌缺血（冠状动脉血流突然减少或停止）引起，导致心脏生物标志物异常释放到外周血中。具体而言，血液中心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量的异常升高，已成为AMI患者早期诊断和预后评估的高度特异性适应症。因此，迫切需要一种快速、高灵敏度的cTnI检测（hs-cTnI检测），以满足对AMI快速、准确、早期检测的需求，并有助于在发病早期及时预警，挽救患者的生命。

侧流检测 （LFA） 是一种典型的即时检测 （POCT） 方法，可在 30 分钟内提供结果，并在快速检测中，得到广泛应用。本文以用于cTnI夹心免疫检测的最广泛应用的纳米金LFA作为典型例子，在当前LFA中引入抗原-抗体结合。1. 当含有cTnI的样品溶液（例如，外周血血清）加载到侧流试纸上，cTnI将与纳米金标记的抗体结合，形成“cTnI-抗体-纳米金”，作为可检测的复合物。可检测的复合物、抗原和纳米金标记的抗体（简称“多复合物”），将从偶联垫中释放出来。然后，由于毛细血管的作用，多复合物将沿着侧流膜流动，并被涂在测试线（T 线）上的抗体，和涂在对照线（C 线）上的抗体选择性捕获。在这种方法中，侧流膜显然至关重要，以驱动样品溶液通过被动微流控的流动，并选择性地捕获溶液中携带的复合物。目前，大多数侧流膜由微米直径的纤维丝制成，并富含许多内部微小孔隙，以下称为“纤维基色谱膜”。虽然调整纤维的疏水性和亲水性，可以实现样品溶液的流动和抗体的固定化，但这种修饰也限制了LFA的性能，特别是增加了检测时间，降低了检测的信噪比（SNR）。样品溶液在纤维色谱膜中的缓慢流动（通常小于0.5 mm s−1），将LFA的检测时间延长至15-30分钟。2.纤维基色谱膜中丰富的孔隙会捕获样品溶液，导致可检测复合物的非特异性吸附增加和多复合物的捕获。3. 除T线和C线外，纤维基色谱膜区域中残留的可检测络合物，会减少到T线和C线的复合物量，导致检测信号下降。4. T线和C线残留的多复合物（具体指纳米金标记的抗体和“抗原抗体-纳米金”）会增加背景噪声，导致信噪比欠佳，甚至出现假阳性的结果。为了解决这些局限性，需要新一代的侧流膜，该膜可提供更快的溶液流动速度和更低的样品溶液残留，并有助于提高LFA的性能。

在这项研究中，团队提出了一种带刺的箭头状结构膜（BAS Mem），可以促进液体的单向和快速流动。BAS Mem的表面，从头到尾，具有相互连接的带刺箭头状凹槽，凹槽以侧壁为界。BAS Mem上带刺箭头状凹槽的侧壁，是驱动液体快速流动和限制液体向相反方向流动的关键。BAS Mem拥有14.5的超高流动系数，以及比硝酸纤维素膜 （NC Mem） 高约23倍的超快液体流速。团队进一步使用BAS Mem作为侧流条带的侧流膜，来研究其LFA的检测性能。结果表明，在侧流条带中采用BAS Mem可以减少检测时间，提高LFA的信噪比。随后，团队使用BAS Mem制备成批的侧流条带，并开发用于超快速 hs-cTnI检测的纳米金LFA。基于所提出的侧流条带的LFA， 可在短短240秒内提供结果，检测限 （LOD） 为1.97pg mL−1。在 25 例疑似AMI患者的血清样本检测中，检测结果显示特异性为100%，灵敏度为93.3%。根据美国国家临床生物化学学会（NACB）和国际临床化学联合会（IFCC）的实验室医学实践指南，该方法符合hs-cTnI检测的要求，有望实现AMI早期诊断，从而挽救患者的生命。

https://www.nature.com/articles/s41467-024-49810-z

研究进展

02

BAS Mem的设计及单向传输原理

团队设计了BAS Mem的表面结构。它可以单向驱动水流，通过分析作用在弯月面上的力，研究了液体在膜上单向流动的原理。BAS Mem用作侧流膜，来构建侧流条带，并开发用于超快速hs-cTnI检测的纳米金LFA，这有助于诊断 AMI。BAS Mem表面具有平行和等距的微通道。微通道由从头到尾相互连接的带刺箭头状凹槽组成，称为“结构单元”。结构单元由一组轴对称分布的长弧侧壁和短弧侧壁包围。长弧侧壁与短弧侧壁呈0°角切向，在侧壁相交处形成尖角。BAS Mem上的这些独特结构，是通过激光雕刻、铸造和热压花技术制备的。首先，团队在铝板上激光雕刻微通道，以生产金属模具。然后，团队将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物倒入模具上，加热以获得PDMS母体。随后，团队使用热压缩机，将PDMS母版的图案压印到聚合物膜上，例如，高密度聚乙烯（HDPE）膜。在膜的表面图案上涂上亲水涂层后，BAS Mem的研制完成。

BAS Mem的设计和结构表征、BAS Mem上的液体单向流动原理、模拟条带上的液体流动，以及BAS Mem在构建超快速hs-cTnI检测的侧流条带中的应用。

该设计可以在各种材料上加工，例如，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚丙烯（PP）。通过上述研制技术，团队能够避免使用纤维丝。纤维丝通常是疏水的，带负电荷的纤维（如硝酸纤维素的纤维），并且可以非特异性地吸附多种复合物。团队以不同材料的BAS Mem为原料，从牛血清（F-BSA）中运输FITC标记的白蛋白样品溶液。结果表明，BAS Mem上蛋白质的非特异性吸附率，低于NC Mem。此外，团队还使用HDPE膜研制了多批次的BAS Mem，并将其用于驱动液体。经过验证，团队使用的研制技术，可以保持不同批次的性能一致性。BAS Mem表面的长期亲水性，也已得到验证。研制的BAS Mem，始终保持其亲水性能，在贮藏6个月后，能有效运输液体。由于BAS Mem具有单向驱动液体的能力，可用于构建LFA的侧流带。侧流带的BAS Mem的流速较高，而T线的流速较低。T线处流速的降低，导致液体在该位置的停留时间更长。这种延长的停留时间至关重要，因为它为“抗原-抗体-纳米金”复合物，与固定在 T 系中的抗体之间的免疫结合，提供了足够的时间。使用BAS Mem作为关键组分，构建了侧流条带，以开发纳米金LFA，可用于超快速hs-cTnI检测。使用侧流试纸，检测外周血中cTnI浓度，仅需4分钟，有望实现AMI的早期预警，并协助诊断AMI的症状。例如，胸痛。该产品有助于AMI的早期应急管理和治疗，从而降低患者的死亡率。

BAS Mem构建的试纸条，可用于超快速hs-cTnI检测

团队使用BAS Mem构建了用于超快速hs-cTnI检测的侧流条带，其特点是液体快速、单向流动和样品溶液残留量低。首先，团队通过侧流条，检测样品溶液中的cTnI。该实验使用含有cTnI的PBS溶液，作为样品溶液。上样后约1.1秒，样品垫中的样品溶液，流向偶联垫，并从偶联垫中释放纳米金标记的抗体。随后，纳米金标记的抗体，与样品溶液中携带的cTnI抗原结合，形成可检测的复合物（称为“纳米金标记的抗体-cTnI抗原”）。携带这些复合物的样品溶液，流过BAS Mem上的T线和C线，在约32.6秒到达吸收垫。复合物和纳米金标记的抗体，分别在T线和C线处，被抗体选择性捕获，呈现红色。吸收垫不断吸收多余的溶液，并完成检测。T线的颜色强度，稳定在240秒，表明侧流条带，能够在240秒内检测到cTnI。

使用BAS Mem构建的侧流条的超快速hs-cTnI检测。

与其他知名品牌的纳米金条比较

采用BAS Mem的纳米金侧流条带，可提供超快速的hs-cTnI检测。这些侧流试纸仅需240秒，即可获得结果，灵敏度为 93.3%，特异性为 100%。基于BAS Mem的超快速hs-cTnI检测的LOD，为0.00197ng mL−1，这与市面上销售的hs-cTnI 仪器的LOD，性能相当。团队将侧流条带与其他市面上销售的纳米金cTnI条带进行了比较，并且，参考了检测时间、灵敏度和特异性。值得注意的是，大多数商业试纸条的cTnI检测，需要15-30分钟。它们比本产品的检测时间，高3-5个数量级，尽管，它们的灵敏度和特异性相当。

研究结论

03

本研究设计并研制了一种BAS Mem，可促进液体的超快速单向流动。BAS Mem上的液体单向向前流动，并且由于来自结构单元侧壁的力，在尖角处受到限制。BAS Mem的整体流动系数为 14.5，是目前所知的最高值。对于单向流动，接触角 （θ） 应介于 48° 和 64° 之间。此外，可以通过改变BAS Mem的表面接触角，来调节液体的流速。团队对流体控制的机理进行了研究，并提出了利用BAS Mem的侧壁驱动和固定液体的原理。这种流体控制的机制和原理，可以为微流控领域的其他流体行为分析，提供新的思路和方法。此外，它可能广泛适用于解决与流体控制相关的技术问题。这些特性，使BAS Mem在微流体和液滴收集等方面的应用前景广阔。

BAS Mem在单向驱动样品溶液方面具有优异的性能。侧流条带中的BAS Mem，可用于减少检测时间，并提高LFA的灵敏度。与其他市面上销售的cTnI试纸的性能相比，本研究所提出的侧流试纸条，节省了66.7%–86.7%的检测时间，并以较低的成本，实现了3–5个数量级的LOD。

与传统的基于纤维的色谱膜（如NC Mem）相比，BAS Mem在表面输送液体，为LFA中的可测试样品分子和抗体标记的信号放大纳米探针，提供了更多种类的样品溶液类型、更广泛的尺寸范围。这一特性显著拓宽了LFA的适用性，特别是对于那些较大的靶标生物标志物（如某些病毒颗粒或多糖）和抗体标记的信号放大探针（如金颗粒和磁珠颗粒）。这些探针，很难用传统的NC Mem进行处理。与使用NC Mem制成的试纸条相比，使用BAS Mem制成的侧流条带，在T线处的检测信号，增加了541.8%，噪声降低了84.7%。侧流条的信噪比为19.2，比NC Mem制成的信噪比高32倍。因此，BAS Mem 通过促进流体流过其表面微通道，为靶生物标志物和抗体标记的信号放大探针，提供了更广泛的选择空间。侧流试纸可以检测更大尺寸的生物标志物，并为最近遇到的更大尺寸抗体标记的信号放大探针的保留，提供了解决方案。

因此，BAS Mem展示了其作为侧流膜的卓越潜力，以促进超快速hs-cTnI检测，有望实现AMI的早期预警，并进一步扩大其在突发公共卫生事件、自检、食品安全和环境分析中的适用性。