藻胆蛋白的自我介绍之别藻蓝蛋白篇

上期介绍了藻红蛋白的特点以及它与抗体的缀合实验方案，这期咱们来学习一下别藻蓝蛋白。

「别藻蓝蛋白（APC）的特点:」

1.从蓝藻中纯化

2.具有极高的发射量子产率

3.荧光团与蛋白质主链共价结合，不被淬灭

4.高水溶性

「APC与C-PC(C-藻蓝蛋白)的区别」

「APC与C-PC的对比」

「交联APC与APC的对比」

1.APC结构：它具有α和β亚基，具有明显的(αβ)3 四级结构。

2.为什么要将APC进行交联 ?

答：交联是为了防止APC在稀释或暴露于变性盐(如尿素或盐酸胍) 时

发生可逆解离，从而保持其结构和功能稳定。

3.如何进行APC交联?

答：通过α和β亚基间的特异性交联可以阻止APC的分解。

A P C

注：图中的红色线条为没有添加NaClO4, 蓝色线条为添加了NaClO4。

如图及表中信息所示，CL-APC图中添加NaClO4 及没添加NaClO4, 吸收比没有明显变化。而在未交联的APC中，添加NaClO4, 得到的吸收比有非常大的变化，因为APC中加入了NaClO4 导致了它出现了解离。

「APC与抗体的缀合实验方案」

注1:整个缀合过程可以在一天内完成。但是，缀合前对APC的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为 2 mg/ml的抗体溶液。请您在进行APC抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注2:SMCC-APC缀合物非常稳定(在“交换缓冲液”中，在4℃下至少可以稳定几个月)。因此，如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10 毫克或更多的APC,并将其用于几次抗体实验(在几周内)。SMCC-APC的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

一 .APC的制备

1.将APC纯化。缀合前的浓度通常为5-10 mg/ml。注意：APC在缀合前作为SAS(硫酸铵钠)沉淀物最稳定。如果将APC以SAS沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。在用每毫升1升的“透析缓冲液”透析之前，用每毫升1升APC的PBS进行透析2次。

2.使用1.7毫克APC修饰每毫克lgG,包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3.检查APC的纯度和浓度，请测量280、620和655nm处的吸光度。(1mg/ml的APC在655nm处的OD 为5.9) 。655/620 比率>1.4表明杂质被充分去除；655/280 比率 > 4 表明所有其他蛋白质均已充分去除。

二 .APC的活化

1.使用前在无水DMSO中制备10mg/ml的SMCC储备溶液。

2.每毫克 APC加入6μlSMCC,并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60分钟。

3.将纯化的APC过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC相对APC的量，可能会有所好转。

三.1gG还原

1.在蒸馏水中制备1MDTT(15.4mg/100μl) 的新鲜溶液。

2.1gG溶液浓度应为4mg/ml或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES、磷酸盐和TRIS缓冲液(pH范围为6至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于2mg/ml,则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升IgG溶液加入 20μ lDTT原液并搅拌。室温下静置30分钟，无需额外搅拌(以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。

4.将还原的lgG通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT浓度可能会有所帮助。

四.进行缀合

1.每毫克IgG添加1.5毫克SMCC-APC。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这些摩尔比(每1gG约2个APC)效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2.60分钟后，必须去掉 lgG上未反应的游离巯基。

3.在 1.0ml干DMSO中制备10mgNEM的新鲜溶液。

4.每毫克|gG添加 34μ g(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20分钟。