保护重点地区监测鲨鱼和鳐鱼贸易的通用封闭管条形码技术

研究一种便携式、通用的基于DNA的工具，该工具将极大地促进现场监测，印度尼西亚爪哇岛收集了鲨鱼和鳐鱼样本，并选择了28个常见物种列名的物种。

根据DNA熔融曲线特征来识别物种，通过结合视觉和机器学习的分配方法，我们成功区分了28个物种，其中20个物种被列入了CITES名单。

通过进一步的改进，这种方法可以在没有实验室或物种特异性检测方法的情况下，改善全球范围内的软骨鱼类贸易监测。

鲨鱼和鳐鱼群体由于钓鱼压力，无论是有针对性的还是作为副捕获物，具有动物界中最高的灭绝风险之一，而且这种情况还受到它们保守的生活史的影响。

尽管一些软骨鱼类渔业可以进行可持续管理，市场对鲨鱼和鳐鱼产品的需求，通常导致过度开发。

事实上，过去十年中，CITES附录II中的软骨鱼类名录数量不断增加，在2022年的第19次缔约方大会上，名单数量增加了两倍多。

其中各方同意将所有剩余的灰鲨54个物种、6个锤头鲨物种和37个吉他鱼物种添加到附录，还将7个巴西淡水魟鱼物种列入了附录。

这些名单的规模和速度，为拥有大量多样化鲨鱼和鳐鱼产量的国家，如印度尼西亚，带来了重要的实施挑战。

这尤其令人担忧，因为印度尼西亚拥有全球近四分之一的软骨鱼类多样性，印尼当局已经采取了一些措施来减少软骨鱼类群体的下降。

例如：增加受保护物种的数量，广泛的宣传活动，改善数据收集和库存评估，扩大海洋保护区，以及建立港口国措施来打击非法捕捞。

由于它们在外观上相似且大多数衍生产品中缺乏独特的特征，参与贸易的人员可能会有意或无意地错误标记软骨鱼类物种。

活性资源贸易的一般缺乏透明度，是渔业和保护管理的持续关注点，可能对库存管理产生负面影响，并损害整个部门和国家的声誉。

已建立的DNA条形码技术，和迷你条形码技术，可以在新鲜和加工样本中强大地识别物种，然而，这些传统的DNA条形码方法，需要更长的处理时间和高昂的测序成本。

近年来，实时聚合酶链反应的进展消除了测序阶段，从而允许在现场进行物种识别。

该方法使用目标特异性引物和荧光染料，在PCR扩增过程中检测目标核酸模板的存在，已成功应用于在单一运行管中，检测多个CITES列名的鲨鱼物种，以及多重引物等渐进PCR技术。

因此，在不设计物种特异性检测的情况下，仍然需要一种快速简便的方法来识别任何样本。

当检查员需要处理多种不同物种的多种产品，并且需要在有限的时间内调查物种组成时，这个问题尤为突出。

由于CITES规定，仍允许附录II中列名的物种，通过考虑非有害性调查框架，来进行可持续开发的贸易，因此贸易监测比以往任何时候都更为重要。

为了规避物种特异性方法的限制，一种称为FASTFISH-ID的通用单管分析法，最近在海产品行业中开发出来。

然后，将这些荧光标志与云库中的经过验证的标本标志进行比较。

这种方法及其库最初是为硬骨鱼类设计和验证的，FASTFISH-ID云中，尚未公开软骨鱼类的荧光指纹。

因此，我们选择测试以下两个问题：现有的FASTFISH-ID诊断能否产生多样性的、独特且特定于印尼贸易中，经常出现的28种软骨鱼类的荧光标志。

深度机器学习方法是否能定量地将标志分配给正确的物种，不受荧光视觉外观的影响。

其实，深度学习算法在灵活性上非常强大，非常适合执行这些任务，最近已在海洋科学中应用，包括鱼类大小估计、副捕获物检测和从照片和视频中识别鲨鱼。

在过滤和移除33个不一致的运行数据后，生成了来自28种物种的357对荧光标志，其中包括14种鲨鱼和14种鳐鱼，其中22种物种是CITES列名的物种。

在2.5小时内，从新鲜样本到来自不同部位的加工样本的所有类型样本，均被扩增并产生了一个或两个荧光标志。

这两个条形码段，是指扩增的COI目标序列中，两个迷你条形码区域，通过发出荧光以供实时聚合酶链反应仪读取。

然而，一些物种显示出探针条形码杂交困难，受影响的鲨鱼物种多于鳐鱼物种，即Carcharhinus falciformis，Carcharhinus longimanus，Isurus oxyrinchus，Lamna nasus。

然而，一些显示出较差的探针条形码杂交的物种，仍然可以通过替代的条形码段进行区分。

在两种狐鲨物种中，FASTFISH-ID在杂交过程的初始阶段产生了视觉可区分的BS1曲线，并在约74-79°C处产生了类似的下降，而BS2中的标志在初始阶段明显不同。

另一方面，有些物种在BS1上几乎具有相同的标志，但可以通过BS2区分，例如斑纹鲨和斑尾鲨。

然而，存在一些问题物种对，其两个部分具有高度相似的标志，因此在视觉上难以区分。

总体而言，在28种物种中有6种被认为在视觉上无法区分，其中有4种是CITES列名的。

我们还发现有7种物种的扩增结果不一致；短鳍真鲨，大洋白鳍鲨，大眼鲨，虎鲨，大齿锯鱼，巨型铲鼻鳐和平滑鼻楔鱼。

我们将训练集的数据进行转置，然后使用8,152个温度间隔的荧光值作为变量，并将变量重要性确定为物种分配的关键特征。

我们根据相对重要性、缩放重要性和解释的方差百分比对变量状态进行排名。

分配错误与在视觉评估中也被证明有问题的物种一致，例如旋转鲨和蓝鲨，模型还错误地将斑尾鲨误认为斑纹鲨，尽管在视觉上斑尾鲨在BS2中具有独特的标志。

在测试中，一些来自双髻鲨、平滑鼻楔鱼和宽鼻楔鱼的样本被分配到错误的物种，尽管每种物种都具有自己独特的指纹。

仅需几个小时，无需调整现有的FASTFISH-ID法从硬骨鱼类转变为软骨鱼类，这种实时PCR方法提供了一种可靠的便携式监测工具，可以可靠地识别25种软骨鱼类物种。

更重要的是，使用具有高种间变异性的小条码，作为探针提供了其他基于qPCR的检测方法，目前不提供的普遍性。

而将全长COI条形码自动放大作为相同反应的一部分，则为进一步深入的筛选提供了下游机会，如果需要的话。

尽管现有的基于遗传学的监测工具在许多情况下仍然有用，FASTFISH-ID似乎准备大大扩展基于DNA的控制范围：除了其速度、便携性和通用性外。

该方法还表现出单核苷酸分辨率，这可以最小化类似荧光标志的风险，特别是当更多的物种被添加到参考库中时，这是尤其重要的。

基于遗传的贸易监测，通常遇到处理加工产品的困难，而这在软骨鱼类中尤为明显，因为软骨鱼类往往以多种方式进行加工。

由于FASTFISH-ID使用实时PCR并依赖荧光标志，因此一些物种在荧光标志中显示变化，尤其是当DNA被降解时，如加工产品中所观察到的，由两个锤头物种的标志显示。

当DNA降解时，这种偏离可能对物种分配构成问题，特别是当分配依赖于深度学习算法时，这些特征的高概率与其他物种的相似特征导致了分配错误。

可能发生的另一个问题，是来自同一物种的荧光标志的变化，这可能是由于物种内的单核苷酸多态性，或在巴西扁鳝BS2标志的情况下，可能是由于污染导致的。

该方法也可以被督察员轻松应用，而无需应用计算工具，可可靠地揭示非法活动案例。

三对物种具有难以区分的光谱特征，例如虎鲨和巨大鼻楔鲨之间存在这些模糊之处，以及两种Mobula鳐的物种之间存在这些模糊之处，以及丝质和蓝鲨之间的模糊之处。

因此，必须承认这些条形码段具有相同的核苷酸序列，对于这些物种来说，它们产生了类似的标志。该技术最初是为硬骨鱼类设计的。

尽管已经知道COI基因在软骨鱼类中的演化速度，比硬骨鱼类要慢，这在大多数DNA条形码应用中很少成为主要问题。

随着训练数据集的增加，可能需要增加训练数据集，因为这应该会提高模型的鲁棒性，而将来将条形码区域重新调整为软骨鱼类的变异，可能还会消除一些物种内部的噪音。

尽管存在分配问题，当我们将视觉和深度学习分配结合在一起时，我们可以区分28种物种中的25种。