Diabetes Care：低血糖导致的Ⅰ型糖尿病患者意识受损与涉及唤醒，决策和奖励脑区的局部脑血流异常有关
Diabetes Care：低血糖导致的Ⅰ型糖尿病患者意识受损与涉及唤醒，决策和奖励脑区的局部脑血流异常有关
低血糖导致的意识受损（Impaired Awareness Of Hypoglycemia, IAH）影响着四分之一的Ⅰ型糖尿病患者的生活，并显著增加了低血糖的风险。而大脑对于低血糖区域性响应的差异可能正是这些人群对于低血糖问题易感的原因。本研究中使用3D持续动脉灌注标记（pseudo-Continous Atrial Spin Labeling, 3D pCASL）技术以及功能磁共振技术测量一型糖尿病中低血糖患者（HA）与低血糖致意识受损患者（ IAH）大脑局部脑血流（Cerebral BloodFlow，CBF）的变化，以比较不同组别被试的大脑对于低血糖响应的差异。
研究中分别选择了15名HA患者以及19名IAH患者（两组被试都是I型糖尿病患者，区别是HA没有意识受损，IAH为意识受损）使用3D pCASL序列采集在两步法高胰岛素葡萄糖钳夹作用下的影像数据。并测量患者对于低血糖（47mg/dL[2.3mmol/L]）下的症状表现以及激素、全脑和局部脑区脑血流的响应情况。
结果显示，IAH患者对于低血糖的响应在症状评分上无明显改变（p=0.25）而在HA被试中存在显著升高（p<0.001）；激素水平上，在IAH组中肾上腺素、皮质醇和生长激素对于低血糖变化的响应较低（p<0.05）；脑血流上两组都有明显的变化（AH P<0.01,IAH P<0.04）。但是在组间无显著差异。局部脑血流上，与HA组相比，发现IAH组在丘脑（thalamus），右外侧眶额皮层（Right Lateral OrbitoFrontal Cortex，RLOFC）和右背外侧前额叶皮层（Right Dorsol Lateral Prefrontal Cortex，RDLPFC）的脑血流变化有所降低，而海马区域的下降更为明显。其中丘脑与右外侧眶额皮层表现出可通过Bonferroni 矫正的强显著性。本研究发表在Diabetes Care杂志（可添加微信号siyingyxf或18983979082获取原文及补充材料）。
正文：
低血糖导致的认识损伤影响着四分之一的一型糖尿病患者，由于其无法敏感可靠的感受到低血糖带来的影响，从而提高了低血糖三到六倍的风险，使其呼叫救护车的风险高了一倍。而反复发作的低血糖会减弱症状强度和激素反应，从而防止血糖下降。在IAH患者与糖尿病的归属关系上，IAH患者常伴随长期的糖尿病史，但是一型糖尿病患者的主体人群中并未患IAH。而事实上，虽然大多数人每周都会有两次低血糖发作的情况，但是他们仍然能清晰地意识到低血糖的影响。这或许说明有其他更加重要的贡献者导致了IAH（低血糖致意识受损患者）的出现。在行为上，诸如对于医嘱的低服从和低血糖的低关注度等已被认为与IAH无关。而这是否是由于大脑中负责行为与决策脑区的适应性变化有关仍未可知。正电子成像（Positron Emission Tomography, PET）以及功能磁共振（functional MRI, fMRI）等技术也已被用于研究在一型糖尿病患者与健康人群对于低血糖大脑区域性响应的差异，然而人们对于低血糖意识的状态还无法做出合理的解释。作为一个对于不同响应差异化描述的重要媒介，全脑脑血流数据在不同研究中存在着差异。因此，本研究中使用3D pCASL与fMRI技术来研究HA与IAH患者对于低血糖响应的差异。
研究设计与方法：
被试：
本文的主要研究对象为右利手的非肥胖Ⅰ型糖尿病患者，并且排除了Ⅱ型糖尿病、肾功能损伤、患心血管疾病、外周血管疾病或中风患者、主要心理诊断患者，这些非脑功能损伤患者以及有严重的颅脑损伤、神经系统中或引起MRI变化以及其他限制使用MRI病史的患者。被试的分组根据患者的临床病史以及发作期间的回顾性描述确定Gold得分。这是一种有效的低血糖认知评估方法，当得分在1~2时认定为HA组，得分在4~7之间时认定为IAH组。
研究方法：
按照前人的研究结果，符合实验要求的被试在扫描前需要避免饮用含酒精和咖啡因的饮品，并避免剧烈运动。在开始扫描的前实验被试要进入封闭的实验环境、随后多次注射胰岛素，以保证身体一定的血糖水平，并要求被试无使用超长时效基础胰岛素的用药史。被试会在扫描开始前一晚进入准备室，由基本的胰岛素注射方式转为持续性剂量可调的方式为被试补充胰岛素，期间每隔30到60min采集血液样本，以保证血糖含量稳定在90~144mg/L（5~8mmol/L）之间。晚10点后，若被试血糖低于81mg/dL，则只能通过饮水以及基本的低血糖治疗以保证较低的血糖水平。当血糖水平低于54mg/dL时将重新调整研究时间。在扫描前一小时，开始高胰岛素钳夹处理，将血糖水平维持在90mg/dL。灌注的IV胰岛素以1.5mU·kg-1·min-1的速率持续输液以替换原来胰岛素，并作20%的葡萄糖替换率维持血糖水平。实验中，每隔5分钟采集一次血液并提取血浆，使用葡萄糖氧化酶分析仪，分析血糖含量。扫描过程中，被试仰卧在扫描舱内，并佩戴降噪耳机，降低扫描噪声的影响。扫描期间为降低头动的影响，会要求被试尽量保持不动。在3D pCASL 1和2（ASL 1和ASL 2）中，血浆在扫描仪中的血浆葡萄糖保持在90 mg / dL（5 mmol / L）30分钟。此后，在20分钟的时间内降低血浆葡萄糖。一旦达到47 mg / dL（2.6 mmol / L）并维持20分钟，便进行3D pCASL扫描3和4（ASL 3和ASL 4）。每次扫描后都会测量被试的血糖与激素水平以及的，行为特性以客观评估被试对于低血糖的感知情况，另外，也会让被试评估自己低血糖的程度（1为最轻，7为最重），比较两种评估方式，就可以较为客观的了解被试对于低血糖的感知的强弱。按照自主神经性与神经性糖尿症状分别划分了7和4个症状。评分结束开始下一次扫描，评分过程中患者无法看到多指标下的客观评判结果，消除真实评分对其自评的影响。扫描结束后，被试便停止胰岛素输入，开始食用碳水食物，使血糖恢复到正常水平。若出现溶血，则还需最少住院观察48小时，直到恢复正常后方可出院。
生物化学分析
被试激素水平的检测，使用采用高效液相色谱电化学检测分析肾上腺素和去甲肾上腺素。采用自动免疫分析法分析皮质醇、生长激素和游离胰岛素。
临床指标与人口信息的分析与统计
数据的统计使用SPSS进行，如年龄这样的连续的人口信息使用非配对的两样本T检验进行，对于性别这类的分组变量使用卡方检验，检测性别的匹配性。组内的症状评分、平均血糖含量以及激素反应使用配对样本T检验检测匹配性，配对样本t用于检测组内的变化差异。数据的表示以平均值±标准差的形势呈现，统计的显著性水平设置0.05。被试临床信息的匹配性分析如下表所示。
表 1被试信息匹配性分析结果
统计效力的计算
既往一项针对9个健康被试的PET研究发现，低血糖状态下海马区的脑血流降低了26%，皮层与脑干的脑血流变化6.4%到7.8%。Page团队对9个被试的研究发现组内对于低血糖的反应在下丘脑区域性CBF由22.9到44.5mL/100g/min。另一项研究中发现在12名对照与11例IAH患者之间在丘脑和眶额皮层有8%到10%的差异。根据以上研究结果，本文有80%的把握在12位患者的效应大小为0.6，局部CBF变化约为5%。
核磁数据的采集与分析
数据采集
Asl 数据的采集使用Ge的3T核磁扫描设备，使用pCASL序列采集，并在采集主机上导出计算完成的CBF数据，除了asl数据外还采集了被试T1和T2结构像用于后续的配准操作中。另外通过结构像的观察排除了那些包含病灶的被试。
神经影像的统计分析：
脑血流图（CBF Map）的统计使用SPM12(Statistical Parametric Mapping)进行。但是在统计前需要将脑血流图配准到MNI（Montreal Neurological institute）标准空间下,以便于进行基于全脑的统计分析。这里我们使用伦敦皇家理工学院开发的自动化ASL处理工具ASAP(automatic software for ASL processing)作预处理。第一步需要通过两部配准法将脑血流图批准到标准空间下，首先我们先利用M0图像求脑血流与到个体结构像的变换关系，将个体的脑血流图配准到个体结构像下，随后通过分割将结构像分为灰质白质脑脊液，利用中间生成的只包含脑组织的mask与CBF作掩模处理（点乘），获得到了去除脑外组织的图像数据，分别计算灰质、白质及脑脊液到标准脑的变换关系，最后利用这个变换关系，让脑血流图配准到标准脑上。最后使用平滑核为8mm的高斯核函数对图像作空间平滑，消除由于配准中的插值引入的噪声。
对于每个被试，分别计算正常血糖与低血糖状态下的CBF的均值。血糖水平变化间的全脑CBF的改变通过测量全脑灰质体素CBF均值做差获得。统计中使用spm12进行基于体素的统计，从而了解不同组被试大脑局部脑区脑血流的差异。组内的CBF变化的差异使用配对样本T检验，分组间的差异比较使用非配对的两样本t检验。
统计结果使用团块水平的FWE矫正作多重比较矫正，设置团块级别的矫正水平为0.05，体素级别显著性水平设置为0.005。随后使用SPM作2×2的重复方差分析分析了不同分组与状态下的交互作用。这里的矫正方法与上相同，使用团块水平的FWE矫正，团块级别显著性设为0.05，体素级别显著性设置为不校正的0.005。另外基于先验知识的假设分析，选择了丘脑（thalamus）前联合（Anterior cingulate cortex，acc）腹侧前额叶（dorsolateral prefrontal cortex, DLPFC）、OFC（眶额皮层）以及海马区作为感兴趣区域作组间分析。这些感兴趣区域基于前人研究中对低血糖敏感的分析从PickAtlas中获得。
对每个结构像定义下的ROI中的所有体素进行统计分析，从而对小体积或小体积校正进行调整。 SPM中的小容量选项用于将相同的统计模型应用于每个ROI中的所有体素。使用峰值水平的显着性值，其推论来自对FWE的校正（即，多重比较），包括ROI的所有体素。对ROI的数量进行了额外的Bonferroni校正，其临界p为0.01。在每个分析中都使用了灰质mask，并将全局CBF作为协变量添加到每个模型中，以控制全局灌注的效果。为了证明整个ROI中CBF的变化幅度，使用SPM和ASAP从每个ROI中的所有体素中提取了平均CBF值。分别使用配对和未配对的T检验比较不同分组与不同血糖水平下脑血流的差异。
分析结果：
被试临床信息：
实验中一共采集了15名带HA症状的一型糖尿病患者，以及23名带IAH症状一型糖尿病患者。另有4名潜在患者在扫描过程中对低血糖无明显的感受，后通过Gold评分和病例分析选择进入IAH组，最后IAH组有19名被试。入组的被试都有较长的糖尿病史，且在年龄、性别、BMI指数以及HbA等，在实验的设计中，IAH组的Gold得分要显著高于HA组。另外在IAH组中患有严重低血糖的患者相对也最多。
血糖与葡萄糖的相关性
实验被试的血糖水平都符合要求，且在两组之间无统计学差异。正血糖阶段HA组和IAH组的平均血糖含量分别处于96±6mg/dL 以及97±8mg/dL，两组之间无明显不同（p=0.92），低血糖阶段两组血糖含量分别为47±2mg/dL以及46±3mg/dL，组间亦无显著差异，综合平均血糖含量IAH组略高，但是也未呈现出统计学上的显著差异。HA：333mg/kg/min， IAH:412mg/kg/min, p=0.06)，组间胰岛素含量也无显著差异。
Figure 2两组被试随着时间变换，血糖含量变化的曲线
症状评分与激素含量对低血糖响应的统计结果
在HA组中由低血糖引发了较为明显的症状反应。然而IAH组在神经性低血糖症评分由7.4轻微上升到8.8时对于低血糖却无明显的症状评分的改变。总体而言，IAH患者中对低血糖的症状反应要显著低于HA组（P<0.001），肾上腺素对于低血糖的也有类似的反应，相对有所下降（图3）。而两组间去肾上腺素的含量均无明显变化。HA组中皮质醇的含量有明显的升高，而IAH患者没有明显的变化。生长激素在两组中都有增长，只是IAH组中上升较少（图4）。
Figure 3 症状评分，自评以及综合评分的差异统计
Figure 4肾上腺素、去肾上腺素以及皮质醇的变化的统计
Figure 5生长激素的比较，以及全脑CBF变化和丘脑CBF的分布情况
全脑血流对低血糖的响应
在HA组中对于低血糖全脑血流的响应较为明显，而在IAH组中无明显的变化。
局部脑血流对低血糖的响应情况
体素级别的组内分析
在低血糖期间HA组丘脑区域的脑血流显著增加（图5），而左侧海马和颞叶皮质脑血流降低，在IAH组表现为左OFC和DLPFC中的CBF增加，而右侧颞皮层减少。
意识状态影响的组间比较
全脑分析：在全脑范围内的CBF脑血流的方差分析发现在HA于IAH组间无可通过FWE矫正的显著差异。
基于ROI的分析：
比较了海马、前联合、OFC（眶额皮层）、DLPFC以及丘脑这些区域的内平均脑血流变化，即使使用Bonferroni矫正，都可发现HA组被试在OFC以及DLPFC等脑区的脑血流表现出与低血糖的强相关性，丘脑的脑血流变化在两组中都有较强的相关性（图6）。但是在HA组与IAH组中并未发现这些ROI内平均脑血流的差异。SPM框架内的ROI小容量校正分析显示，与HA被试相比，IAH被试的右侧丘脑和右侧DLPFC内的CBF反应减弱，左侧海马IAH的CBF下降更小。右侧丘脑和右外侧OFC（眶额皮层）的差异显著性可通过Bonferroni矫正。
Figure 6基于ROI的脑血流变化分析
表2 全脑CBF与部分区域CBF变化情况的表格描述