跟着小鱼头学单细胞测序-如何使用Cell Ranger V6 (一)
导语
GUIDE ╲
在单细胞的商业化测序平台中，来自10X genomics的测序数据占据了很大的份额。相信大家在平时的科研工作中对10X数据并不陌生, 而Cell Ranger软件作为由10X官方开发的配套分析软件，颇受欢迎。今天我们就给大家介绍一下这款软件主要分析流程和使用。
正文
Cell Ranger是10X公司专门为单细胞RNA测序数据量身打造的分析软件，能够通过直接读取原始下机测序数据，进行比对，定量，聚类， 可视化以及更多的基因表达相关的下游分析，并且结合配套的浏览平台Loupe Browser为用户提供交动式的可视化功能，为大家的分析工作提供了很大的便利。以下文中软件信息及代码均从Cell Ranger官网获取【1】。
Cell Ranger 针对的是基于3'端建库的单细胞RNA测序数据，最近升级到了version 6.0，在算法流程和分析模块上面有了一些更新，新版本中功能在之前四大模块的基础上又新增加了一个，主要包括：
- cellranger mkfastq
- cellranger count
- cellranger aggr
- cellranger reanalyze
- cellranger multi （新增模块）
下图列出了新旧版本支持的不同的建库方案：
模块01
cellranger mkfastq
Cell Ranger的工作流程首先是通过mkfastq模块将Illumina 测序仪产生的 raw base call (BCL) 下机文件拆解成 FASTQ 文件，即将reads进行demultiplex再分配到各自的文库中，然后对每个文库再处理barcodes信息。这个功能其实是对llumina的bcl2fastq软件进行了封装，支持大多数bcl2fastq的参数设置。
mkfastq可以识别两种描述样本文件的格式，第一种是简单的CVS样本文件格式，在大多数测序实验中是比较推荐的。该文件包含三列信息：Lane （样本放置的通道id）,Sample （样本名称）和Index （创建文库用的索引信息）。使用示例如下， 注意这里用的是--csv来设置文件。
$ cellranger mkfastq --id=tiny-bcl \ #输出文件夹的id，默认与—run的文件夹名相同
--run=/path/to/tiny_bcl \ #存储BCL文件的路径名
--csv=cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv #此文件为三列样本描述文件另一种是bcl2fastq使用的Illumina所用的Illumina Experiment Manager（IEM）样本格式。注意这里用的是--samplesheet来设置。
$ cellranger mkfastq --id=tiny-bcl \
--run=/path/to/tiny_bcl \
--samplesheet=cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv 顺利运行后，结果文件会存放于文件夹(MKFASTQ_ID)/outs/fastq_path中。拆分后的目录结构如下所示；我们可以看到每个样本会得到三个结果文件（I1，R1，R2），分别储存了样本index，细胞barcode和reads信息。
MKFASTQ_ID
|-- outs
|-- fastq_path
|-- HFLC5BBXX
|-- test_sample1 #结果文件夹
| |-- test_sample1_S1_L001_I1_001.fastq.gz #index 序列
| |-- test_sample1_S1_L001_R1_001.fastq.gz #barcode信息
| |-- test_sample1_S1_L001_R2_001.fastq.gz #reads信息
|-- Reports
|-- Stats
|-- Undetermined_S0_L001_I1_001.fastq.gz
...模块02
cellranger count
该模块是Cell Ranger中比较重要的功能，使用率最高。得到fastq文件之后，通过该模块对其进行序列比对，细胞过滤，对UMI计数，生成对应的feature-barcode定量矩阵；并通过表达矩阵进行下游的降维，聚类等下游分析。使用示例如下：
--fastqs=/tiny-bcl/outs/fastq_path \ #fastq文件所在路径
--sample= test_sample1 \
--transcriptome=/mnt/refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0 #用于比对的参考基因组其中 --fastqs 用于设置fastq文件所存放的文件路径；如果需要对多个fastq进行合并比对的话，可以输入多个存放路径并用逗号隔开，相对应的在--sample中，也输入多个需要合并的sample名称并用逗号隔开，这样就不用我们额外手动合并了。例如
--fastqs=MKFASTQ_ID/outs/fastq_path1,MKFASTQ_ID/outs/fastq_path2 和--sample=test_sample1,test_sample2。另外Cell Ranger也提供了用于比对的参考基因组，包括hg19,GRCH38,mm10以及ercc92.
这一模块的输出文件很丰富，包括有：
Outputs:
网页版报告（重点）： /outs/web_summary.html
数据指标汇总CVS格式: /outs/metrics_summary.csv
用于与参考基因比对的reads: /outs/possorted_genome_bam.bam
用于与参考基因比对的索引： /outs/possorted_genome_bam.bam.bai
过滤后的表达矩阵（重点）： /outs/filtered_feature_bc_matrix
过滤后的表达矩阵HDF5格式: /outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
原始表达矩阵: /outs/raw_feature_bc_matrix
表达矩阵HDF5格式: /outs/raw_feature_bc_matrix.h5
二级分析结果: /outs/analysis
分子层面信息 （用于cellranger aggr合并样本）: /outs/molecule_info.h5
用于loupe浏览器的输入文件: /outs/cloupe.cloupe结果中需要重点查看的有网页版报告（web_summary.html），该报告列出了详细的数据QC的信息，可用于判断该数据测序质量；而过滤后的表达矩阵（filtered_feature_bc_matrix）则可作为下游分析的输入文件，用于别的软件分析，例如Seurat。
模块03
cellranger aggr
该模块是用于两个或者多个样本的数据整合，即基于cellranger count的输出结果，将同一组中不同样本的表达矩阵整合到一起，并进行标准化。例如当处理多个生物学重复样本时，首先分别对每个样本单独的进行cellranger count定量， 然后通过aggr整合。
下面的示例中，假如我们有三个replicates样本,分别进行了定量分析:
$ cellranger count --id=LV123 ...
... wait for pipeline to finish ...
$ cellranger count --id=LB456 ...
... wait for pipeline to finish ...
$ cellranger count --id=LP789 ...
... wait for pipeline to finish ...基于count的输出结果，构建aggr CSV文件（如下所示），该文件包含样本名称和molecule_info.h5所在的路径名这两列信息。
sample_id,molecule_h5
LV123,/opt/runs/LV123/outs/molecule_info.h5
LB456,/opt/runs/LB456/outs/molecule_info.h5
LP789,/opt/runs/LP789/outs/molecule_info.h5$ cellranger aggr --id=MySamples \
--csv=aggr.csv \
--normalize=mapped #标准化去除不同测序深度的影响；可选择设置为none，不进行标准化该模块的输出结果与count模块的结果类似：
合并后的网页版报告（重点）: /outs/web_summary.html
合并报告JSON格式: /outs/summary.json
二级分析结果: /outs/analysis
过滤后的整合表达矩阵（重点）: /outs/filtered_feature_bc_matrix
过滤后的表达矩阵HDF5格式: /outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
原始表达矩阵: /outs/raw_feature_bc_matrix
原始表达矩阵HDF5格式: /outs/raw_feature_bc_matrix.h5
构建的aggr CSV文件: /outs/aggregation.csv
用于构建Loupe浏览器的输入文件: /outs/cloupe.cloupe模块04
cellranger reanalyze
在模块count和aggr的输出结果中都有一个二级分析结果的文件夹，该文件夹中包含了降维，聚类，差异表达分析等结果。而该模块的作用就是允许用户设定分析参数，来对feature-barcode表达矩阵重新进行二级分析，得到新的结果。
与agrr模块类似，我们可以将想调整的参数保存在CSV文件中，然后设--params来运行， 该部分可调整的参数选项很多，会在下篇文章中重点介绍。
$ cellranger reanalyze --id= 】MySamples_reanalysis \
--matrix=MySamples/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5 \
--params=MySamples_reanalysis.csv #存放调整的参数模块05
cellranger multi
该模块是Cell Ranger最新的V6版本中新添加的，作用跟count模块是类似的，而multi模块主要用于3‘端建库的multiplexing数据，即多个库混合测序的情况。除此之外，仍然建议使用count模块。该模块的运行方法与count类似，也需要设置一个CVS文件列出input library信息。我们将在下篇文章中详细介绍如何设置该文件。
$ cellranger multi --id= MySamples --csv=/home/MySamples.csv小编总结
随着10X单细胞RNA测序数据的增多，Cell Ranger的使用也越来越普遍，在今天介绍的这几个模块中，最常用的应该是count模块，这也是小编在日常分析中常常用到的，而其他的几个模块利用率会稍低。因为一般情况下，我们拿到的10X测序数据都是fastq文件格式，通常是不需要我们从下机文件开始处理，得到表达矩阵后，会使用其他分析工具如Seurat，scanpy等来进行分析，所以在日常分析中通常将Cell Ranger的分析结果作为一个初步质检报告。
Reference:
【1】https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome
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