跟着小鱼头学单细胞测序-如何鉴定肿瘤单细胞中的的CNV

导语

GUIDE ╲

拷贝数变异（CNV）在癌症的发生和发展中起着重要作用。随着单细胞测序数据的日渐增长，如何从单细胞转录组数据鉴定CNV 并进一步区分肿瘤细胞也成为了大家感兴趣的课题，今天我们介绍一款基于scRNA-seq数据鉴定CNV的R包。

inferCNV

R包inferCNV是一款基于肿瘤单细胞转录组数据，识别染色体拷贝数变异的工具。主要原理是通过对比肿瘤细胞与“正常”参考细胞的基因表达，确定每个基因的相对表达强度，最终通过生成的热图来显示每条染色体的相对表达强度。另外，inferCNV基于残差来最小化噪声，以此来预测染色体拷贝数异常区域，进而通过该异质性对细胞进行聚类。这里我们基于其官网的文档为大家介绍如何使用inferCNV。

本地安装

在安装inferCNV之前，我们首先需要安装一个系统包JAGS，大家可根据自己的电脑系统选择相应的版本。JAGS下载地址：

https://sourceforge.net/projects/mcmc-jags/files/JAGS/4.x/

# R version 3.6.0 以上
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
     install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("infercnv")

inferCNV也提供了docker安装：

sudo docker pull trinityctat/infercnv:latest
docker run --rm -it -v `pwd`:`pwd` trinityctat/infercnv:latest bash

数据要求

使用inferCNV之前，我们需要准备以下三个输入文件：

1. 单细胞转录的基因表达数据（gene by cell matrix）：

• inferCNV对smart-seq2 和10x产生的表达矩阵都兼容，基因X细胞（行X列）。
• 矩阵可保存为tab分隔文件；inferCNV也支持稀疏矩阵格式。

2. 细胞注释文件标明肿瘤与正常细胞（annotation file）

文件包含两列信息，一列为细胞id，一列为细胞类型，由tab分隔，不需要列名。

当包含多种正常细胞时，可标注具体的细胞类型，在分析中会对不同类型的正常细胞分开处理；若将其统一标注为“normal”，则会分析中被统一处理；

不同的肿瘤细胞也可通过标注“malignant_{patient}”区分，在聚类分析中可以选择是否根据不同肿瘤细胞来分类。

由于只有在注释文件中列出的细胞才会被分析，因此如果我们只对某一部分细胞感兴趣的话，可以通过修改注释文件来达到subsetting的目的，而不需要对表达矩阵，就方便很多。

3. 基因注释文件，标示每个基因的位置信息

• tab分隔文件，包含四列信息：基因名、染色体、起始位点、终止位点，不需要列名。
• 只有同时出现在表达矩阵中并有位置注释的基因才会被分析，通过修改该文件来筛除部分不感兴趣的基因。
• 该文件中的染色体号出现顺序与输出图中的染色体顺序是一致的，所以建议在这里按照染色体号从小到大的顺利排列。
• 基因的位置信息可以从gtf文件中获取。

WASH7P  chr1    14363   29806
LINC00115       chr1    761586  762902
NOC2L   chr1    879584  894689
MIR200A chr1    1103243 1103332
SDF4    chr1    1152288 1167411
UBE2J2  chr1    1189289 1209265

分析流程及使用

inferCNV的主要分析流程包含以下步骤：

1. 基因过滤：设置min_cells_per_gene，筛除表达矩阵中表达量小于阈值的基因

2. 创建preliminary infercnv 对象：包括标准化，log(x+1)变换，基于滑窗方法沿着染色体根据基因表达强度做smoothing处理；估算肿瘤细胞相对于参考细胞的相对表达差异。

3. 得到的preliminary object可进一步进行表达值去噪

4. 预测肿瘤细胞的CNV 位置

inferCNV的基本使用包含两步主要步骤：

1. 基于以上三个输入文件构建InferCNV对象：CreateInfercnvObject()

library(infercnv)
# 构建对象
infercnv_obj = CreateInfercnvObject(raw_counts_matrix="singleCell.counts.matrix",
                                    annotations_file="cellAnnotations.txt",
                                    delim="\t",
                                    gene_order_file="gene_ordering_file.txt",
                                    ref_group_names=c("normal")) 

请注意，当有不同类型的正常细胞类型时，可以修改参数ref_group_names；当没有参考细胞时，参数ref_group_names可设置为NULL，此时对于每个基因，参考表达值为该基因在所有细胞中的表达平均值。该函数也支持通过设置min_max_counts_per_cell来进一步筛除细胞，不过还是建议大家在使用inferCNV之前，先做质控去除低质量细胞。

2. 创建对象之后，可以通过infercnv::run()进行分析

# 主要分析模块，鉴定CNV信号
infercnv_obj = infercnv::run(infercnv_obj,
                             cutoff=1,  # 决定多少基因被用于分析：smart-seq数据最优设置为1, 10x数据最优为0.1
                             out_dir="output_dir",  # 自动创建输出文件夹
                             cluster_by_groups=T,   # 如果有不同类型或来源的肿瘤细胞，TRUE表示据此类型做区分，在做聚类
                             denoise=T, # 去噪
                             HMM=T # CNV 预测
                             )

denoise提供了去噪的选择，当设置为TRUE时，有三种去噪方法可供选择：

• 设置固定阈值，表示与参考细胞表达平均值的固定差异， 例如noise_filter=0.1
• （默认设置）设置动态阈值，表示与参考细胞表达平均值的标准差，例如sd_amplifier=1.5
• 基于noise_filter或者sd_amplifier，将其作为logistic model的中点来缩小与参考细胞表达平均值的差异；例如设置sd_amplifier=3 以及noise_logistic=TRUE

参数HMM提供了CNV预测的分析，设置为TRUE时，有两种模型选择：

• i3 HMM：包含deletion、neutral 和amplification 三态的CNV 模型
• i6 HMM （默认选择）：包含六种状态的CNV模型
• 0x: complete loss
• 0.5x: loss of one copy
• 1x: neutral
• 1.5x: addition of one copy
• 2x: addition of two copies
• 3x: essentially a placeholder for >2x copies but modeled as 3x

shinyApp

infercnv也提供了一款互动分析平台（R shiny app）InfercnvApp，方便对R语言不太熟悉的朋友使用。大家感兴趣的可以尝试一下。

说明文件来自：https://github.com/broadinstitute/infercnvApp/wiki

安装方法如下：

library("devtools")
devtools::install_github("broadinstitute/infercnvApp")
#运行
infercnvApp::infercnvApp()

小编总结

infercnv在癌症单细胞的处理分析比较常用，经常被用来进行癌细胞的判断以及肿瘤异质性方面的分析，代码简练，操作简便，也提供了多种使用平台。我们以后也会为大家多多介绍各类单细胞分析的好用工具，敬请关注！

Reference

inferCNV of the Trinity CTAT Project. https://github.com/broadinstitute/inferCNV