新颖方向利用单细胞公共数据巧发7分+

导语

GUIDE ╲

三阴性乳腺癌 (TNBC) 对新辅助化疗 (NAC) 的耐药性是一项重大的临床挑战，因此，描述肿瘤异质性可以提供对耐药机制和潜在治疗靶点的新见解。

背景介绍

今天小编给大家带来一篇7分+的单细胞文章。本文利用已有的单细胞公共数据分析了一个比较新颖的方向——NAC抗性相关的转录图谱，确定了几个关键基因，及其作为三阴性乳腺癌预后标志物和治疗靶点的潜在用途。文章题目为Transcriptional landscape associated with TNBC resistance to neoadjuvant chemotherapy revealed by single-cell RNA-seq。

数据介绍

单细胞原始RNA-seq数据是从SRA数据库中检索的，登录号为SRA：SRP114962。使用SRA工具包2.9.2版检索数据。FASTQ文件随后与 ENSEMBL hg38 程序集进行伪对齐，并使用KALLISTO 0.42.1对读数进行计数。

结果解析

01

新辅助化疗前后三阴性乳腺癌的异质性

NAC治疗前后样本分为对治疗有响应者（n=4）和对治疗无响应者（n=4）。作者采用ICGS2算法进行聚类。治疗前719个治疗响应者和525个不响应者单细胞和治疗后894个响应和687个不响应者单细胞的无监督转录组分析确定了13个cluster，每个cluster具有不同的分子特征（图1A）。

C1和C12主要存在于治疗前和治疗后无响应者中，并且高度富集类似于急性髓性白血病母细胞和乳腺 (C1) 和骨髓淋巴自然杀伤 (NK) 细胞 (C12) 的基。相比之下，活化的B细胞和单核细胞祖细胞 (C5) 的存在是治疗前响应组的标志。三个集群（C31、C22和C14）在治疗后在响应组中富集，而在无响应组中则较少。这些cluster表示CD56+ NK细胞、髓系白血病前白血病造血干细胞 (C31)、肺巨噬细胞和成纤维细胞 (C22)，以及巨噬细胞和受刺激的巨噬细胞 (C14)。

为了进一步选择特征和描绘细胞群，对来自相同细胞群的数据进行了 UMAP降维分析，结果显示总共有13个cluster（图1B）。C12和C1的基于密度的聚类在其他聚类中显示出清晰的独特模式，没有重叠。

图1

02

对治疗响应者与无响应者的GO术语差异

作者比较了治疗前后三阴性乳腺癌衍生单细胞的响应和无响应者的转录组差异（图2A）。与干扰素γ反应、基因表达和细胞死亡调节相关的GO的富集在响应组中很突出。相比之下，与细胞分裂调节、对蛋白质刺激的反应和血清素代谢过程相关的GO术语在响应组中的代表性不足。免疫反应在响应组中富含的基因中最为突出。差异表达的基因也反映在火山图上（图2B）。

图2

为了验证从发现队列中获得的数据，作者在其他队列验证了top10个上调（CALML5、AZGP1、S100P、IRX1、IRX2、NES、AC013457.1、ACTA2、PIK3R1 和 LRP11）和top10个下调（FTL、 B2M、HLA-DRA、HGB1、LCP1、CXCL9、CD74、IGHG1、CD44 和 UBD）基因，结论也与之前相似（图2C和2D）。

03

创新路径分析（IPA）揭示了生物学途径差异

将对治疗响应组或无响应组中上调的基因置于IPA中，显示了每组中几种经典途径的激活。图3A显示了无响应组中前20条丰富的经典途径，其中突出显示了涉及细胞器发育和细胞功能的途径，如增殖、迁移和侵袭，包括氧化磷酸化、整合素和整合素相关激酶 (ILK) 信号传导（图3A）。

进一步的IPA下游效应分析(DEA)揭示了许多可能受转录组数据影响的受影响的下游生物功能。分层热图基于差异表达的mRNA描绘了受影响的下游功能组，其中带有大小和颜色编码的主要框描绘了疾病和功能类别的差异。无响应组中最丰富的功能类别是细胞运动和细胞生长和增殖（图3C）。

为了进一步探索每个患者组中上游调控对下游功能影响，在IPA中对响应与无响应组三阴性乳腺癌中的上调基因使用了调节器效应器分析管道。该网络确定了7个上游调节因子（5个上调，2个下调）和35个基因层次结构的中间体，它们共同驱动致癌表型，例如细胞周期、增殖迁移和侵袭（图3D）。

图3

04

免疫浸润细胞的差异

对治疗响应组中富集基因集的IPA分析主要涉及免疫细胞运输和细胞间信号相互作用（图4A）。随后，基于差异基因表达分析在来自治疗前后后的响应和无响应组的总共5524个单细胞中寻找所选免疫相关基因的表达。

与治疗前的无响应组相比，响应组中CD19、CD8A、CD4、CD52、CD2、CD53、CD59、CD47、CD74和CXCL9的表达更高（图4B）。在治疗后，响应组的免疫浸润细胞数量下降；然而，在无响应组中观察到相反的情况，在治疗后浸润免疫细胞的数量增加（图4B）。

为了确定两组免疫浸润细胞的功能是否存在差异，对来自CD45+EPCAM− 细胞的转录组进行IPA分析，再次表明响应组的免疫细胞与免疫细胞相比表现出增强的功能，无响应组中免疫浸润细胞的功能受损（图4C和4D）。

图4

05

响应和不响应者的基因特征对乳腺癌患者生存率的影响

三阴性乳腺癌受试者的对治疗响应组与对治疗无响应组的比较分析确定了788个上调基因和244 个下调基因（图4）。随后，对360名患者的第二个队列进行了富集的基因的生存分析。

无响应组的几个基因（CD55、KIF5B、ZFAS1、CAMTA1、LRPPRC、RSL24D1、NEBL、COXC6、PTK2、TCEA1、GDI2、NUDT5和CD46）与 TNBC患者更严重的RFS相关（图5A)。相反，在响应组中上调的几个基因（IGHG2、IGHM、IGLC1、HLA-C、IGHG4、IGHGP、ITGB2、HLA-DPB1、HLA-A和SLAMF7）的表达显示出更好的预后（图5B）。

随后使用Cox回归模型进行了多变量分析，并确定了三基因特征作为RFS的最佳预测因子（图5C）。在预测RFS方面，三基因特征优于其他变量，例如肿瘤大小（连续）、年龄（老年与年轻）、内在亚型（基础与其他）和治疗（PTX和放疗）（P<0.0001，HR=2.2)（表1）

图5

表1

06

靶向去除治疗无响应组基因可减少乳腺癌，并增强紫杉醇敏感性

为了提供对驱动基因及其在紫杉醇抗性中的作用的额外机制洞察，作者根据差异和通路分析，选择了10个基因进行进一步研究。10个上调基因的表达队列（BYSL、ENO1、FDPS、GSTP1、MED20、MRPL9、MRPL37、MYC、NDUFB11和PMVK）随后在782个响应和535个无响应者乳腺癌衍生的单细胞队列中得到验证，这与第一个实验队列一致（图6A)。在来自CCLE数据库的一组 TNBC细胞系中验证这10个基因的表达，表明它们适合作为研究这些基因功能的细胞模型（图6B）。

使用siRNA介导对这10个基因进行沉默，在其作为单一试剂或与紫杉醇(20 nM) 组合的两个三阴性乳腺癌模型中，几种无响应组衍生基因在介导TNBC中紫杉醇抗性方面发挥显著作用（图6C-6F）。

图6

小编总结

本文角度新颖，探究了新型治疗前后对治疗响应和不响应的两组患者基因特征及其生物学通路的差异，进而探讨这两组拥有不同基因特征的患者治疗前后的生存差异和对药物敏感度的差异以及产生差异的潜在原因。虽然单细胞分析过程比较常规，然而对单细胞数据的利用和新颖的分析方式非常值得我们学习和借鉴。