【高分新文】构建免疫相关基因预后指标

An immune-related gene prognostic index for head and neck squamous cell carcinoma

2020 Oct 23

期刊：Clinical Cancer Research（IF:10.107）

导语

GUIDE ╲

与传统疗法相比，免疫检查站抑制剂（ICI）治疗，如针对PD-L1、PD1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 （CTLA4）的治疗，已显示显著益处。在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，抗PD1治疗已被证明是治疗复发/转移患者的一种有前景的治疗方法。

背景介绍

ICI治疗虽然能够临床获益，但一个主要限制是患者的低响应率。免疫微环境（immune microenvironment, TME）等多种因素影响ICI的有效性，很少有生物标志物能很好地预测患者预后。识别与治疗效益相关的潜在预后标志物可以使免疫治疗HNSCC病人。

在本研究中，开发了一种能预测常规治疗和免疫治疗预后的HNSCC预后标志物。聚焦于HNSCC转录组数据中的所有免疫相关基因，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选与患者预后相关的免疫相关hub基因，构建免疫相关基因预后指数（IRGPI）。然后对 IRGPI的分子和免疫结构进行了表征，检测了其在免疫治疗患者中的预后能力，并与其他生物标志物，即肿瘤免疫功能障碍和排斥（tumor immune dysfunction and exclusion，TIDE）以及肿瘤炎症特征（tumor inflammation signature，TIS）进行了比较。结果显示，对于接受传统治疗和免疫治疗的患者，IRGPI是一个有前景的预后生物标志物。

数据介绍

1. TCGA的546个HNSCC样本，包括502癌症样本和44个癌旁样本的RNA-seq和临床病理信息。502个HNSCC样本的分子亚型由 Vonn Andrew Walter和Pierre Saintigny提供。502例HNSCC标本的免疫亚型由Yu-Pei Chen（中国中山大学癌症中心）提供。

2. GEO数据库的270 个HNSCC样本的RNA-seq数据（GSE65858）和生存信息。

3. ImmPort和 InnateDB数据库下载免疫相关基因（这两个数据库小编之前有介绍过：（1）免疫相关数据资源ImmPort （2）免疫互作和信号反应数据库InnateDB）。

4.从RAID 2.0、TRRUST v2和STRING下载mRNA与转录因子（TFs）、miRNA和lncRNA关系数据。

5.cBioPortal下载基因突变数据

方法介绍

1. 识别免疫相关的hub基因

基于TCGA的HNSCC样本的RNA-seq数据，用limma包识别癌症vs正常的差异基因。对免疫相关的差异基因使用clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析。

然后使用WGCNA来识别hub基因。通过计算两个基因表达之间的Pearson相关系数，构建相似度矩阵。然后将相似度矩阵转化为具有网络类型符号的邻接矩阵，然后使用拓扑重叠测度（topological overlapmeasure，TOM）来描述基因之间的关联程度，将矩阵转化为拓扑矩阵。以1-TOM作为基因聚类距离，构建动态剪枝树进行模块识别。基于显著相关模块（蓝色和蓝绿色模块）里的基因，利用权重> 0.2的两个基因之间的边构建网络。网络中度排名前50的基因是hub基因。通过R包maxstat获得每个hub基因对总体生存（overall survival, OS）的最佳阈值，并选择22个显著生存相关免疫相关hub基因进行进一步分析（p < 0.05, log-rank检验）。

使用R包ComplexHeatmap分析了22个免疫相关hub基因的体细胞突变，来揭示相关基因改变。为了确定潜在的调控机制，分析了这些基因在TF、miRNA和lncRNA调控网络中的作用。使用Cytoscape软件对网络中的基因进行KEGG通路分析进行可视化。

2.免疫相关基因预后指数（IRGPI）的构建与验证

在22个免疫相关hub基因中，筛选出影响OS的显著基因，通过多变量Cox回归分析构建IRGPI。每个样本的IRGPI是通过将某些基因的表达值乘以它们在Cox模型中的权重，然后相加得到的。使用K-M生存曲线和log-rank检验来评估IRGPI的预后能力。然后进行了单因素和多因素Cox回归分析。

3.综合分析不同IRGPI亚型的分子和免疫特性及ICI治疗情况

首先对IRGPI评分高（n = 251）和低（n = 251）的样本中的所有基因用R包limma进行差异表达分析。然后使用R包clusterProfiler进行基于KEGG和HALLMARK基因集的基因集富集分析（GSEA）来确定差异表达基因参与的信号通路。然后用R包GSVA对几个代表性基因集进行单样本GSEA （ssGSEA）分析，并分析生存差异。

使用R包Maftools分析两个IRGPI亚型基因突变的数量和质量。对IRGPI score与PD-L1表达及总突变负荷（TMB）进行相关分析。

为识别502个HNSCC样本的免疫特性，使用CIBERSORT 评估22种免疫细胞的相对比例。然后比较两组IRGPI亚型中22种免疫细胞和临床病理因素的相对比例。为了进一步明确IRGPI亚型之间的免疫和分子功能，对某些基因特征进行了ssGSEA，并比较了两个IRGPI亚型之间的评分。

为了分析免疫治疗后IRGPI在患者中的预后价值，对两组接受抗PD-L1治疗的尿路上皮癌（UC）患者进行了生存分析。此外，使用R包timeROC进行了时间依赖性ROC曲线分析，比较IRGPI、TIDE和TIS的预后价值。TIDE score在线计算。TIS score以18个特征基因log2-scale标准化表达的平均值计算。

结果解析

01

免疫相关hub基因

在差异表达分析中（502例肿瘤vs. 44例正常样本），与正常样本相比，肿瘤样本中差异表达基因3877个。将这些基因与从ImmPort和InnateDB获得的免疫相关基因列表交叠，得到1131个差异表达的免疫相关基因，在肿瘤样本中有860个基因表达上调，271个基因表达下调。功能富集分析显示，1131个差异表达基因与127条GO和96条KEGG通路显著相关。

为获得免疫相关的hub基因，对候选基因（n = 1131）进行WGCNA分析。基于average linkage层次聚类和最优软阈值，1131个基因被分配到7个模块。根据每个模块中模块与样本特征之间的Pierson相关系数，蓝色和蓝绿色模块与HNSCC肿瘤密切相关，选择这些模块中的基因进行进一步富集分析。然后获得了threshold degree of > 20的前50个免疫相关hub基因。通过K-M分析，22个免疫相关的hub基因表达与HNSCC患者OS密切相关。

然后分析了22个免疫相关hub基因的特征，发现大部分发生了扩增、深度缺失和错义突变。在TF和ncRNA分析中，hub基因与miRNAs的相互作用对有26对，miRNAs与lncRNAs的相互作用对有59对，hub基因与TFs的相互作用对有37对。去除冗余后，网络中共有118对交互作用，77个基因。

通过使用Cytoscape的ClueGO plugin，对调控网络中的基因进行KEGG通路富集分析，发现它们在与糖尿病并发症相关的AGE-RAGE信号通路、癌症的转录错调和调节长寿的通路中显著富集。

02

不同IRGPI分型的生存情况

为了确定独立的预后基因，对22个免疫相关的hub基因进行了OS的多变量Cox回归分析。如图1A和1B所示，只有3个基因（SFRP4、CPXM1和COL5A1）显著影响HNSCC患者的OS。然后，构建了所有癌症样本的预后指标，计算公式为IRGPI = expression level of SFRP4*（-0.18） + expression level of CPXM1*0.29 + expression level of COL5A1*（-0.23）。TCGA队列中502例HNSCC患者的临床病理特征中的大多数（HPV状态除外）在两个IRGPI亚组中平均分布。单因素Cox回归分析显示年龄、IRGPI、HPV状态和分期与HNSCC的预后显著相关。多因素Cox回归分析证实在校正其他临床病理因素后，IRGPI是独立的预后因素（图1C）。、

以中位IRGPI为cutoff value，IRGPI高的患者效果更好（图1D）。然后，使用GSE65858 （n = 270） HNSCC数据集验证IRGPI。如图1E所示，IRGPI高亚组患者的预后明显优于IRGPI低亚组患者，与TCGA数据集结果一致。

03

不同IRGPI分型的分子特征

首先通过GSEA分析不同IRGPI亚型中富集的基因集。IRGPI-high样本的基因集中富集于DNA修复和免疫应答相关通路（图2A），而IRGPI-low 样本的基因集中富集于癌症和肿瘤转移相关通路（图2B）。接下来，为了进一步了解IRGPI亚型的免疫学性质，分析了基因突变情况。发现IRGPI-high亚组的突变数量明显高于IRGPI-low亚组。最常见的突变类型是错义变异，其次是无义和移码缺失。接下来确定了IRGPI亚型中突变率最高的10个基因（图2C）。接下来，分析了IRGPI评分与PD-L1表达及TMB之间的关系。结果显示，IRGPI评分与TMB的相关性较小，而IRGPI评分与PD-L1无显著相关性。

04

不同IRGPI亚型的免疫特征

为了分析不同IRGPI亚型中免疫细胞的组成，采用Wilcoxon检验比较不同IRGPI亚型中免疫细胞的分布。发现，在IRGPI-high亚型中，CD8 T细胞、naïve CD4 T细胞、激活记忆CD4 T细胞、静止NK细胞和M1巨噬细胞更富集，而在IRGPI-low亚型中，naïve B细胞、静止记忆CD4 T细胞和M2巨噬细胞更富集（图3A）。图3B显示了与免疫景观相关的特征，包括不同IRGPI亚型的临床病理特征。

然后应用特定的基因特征来定义不同IRGPI亚型之间的免疫和分子功能。因此，在IRGPI-high亚组中CD8 T细胞、MHC I类、损伤修复细胞较多，而在IRGPI-low亚组中有更多的免疫抑制细胞和信号以及肿瘤和转移相关信号。

下面进一步研究了是否IRGPI的预后价值来自于更好的免疫控制或较低的肿瘤侵袭性。可以发现上皮-间充质转化、TGF -和WNT -相关信号得分较高的患者，有更差的结果，而具有更多P53突变、CD8 T细胞和巨噬细胞M1的患者有更好的预后。因此，认为IRGPI的预后价值可能来自更好的免疫控制和较低的肿瘤生长侵袭性。

05

IRGPI分型与其他免疫和分子亚型的关系

有一种HNSCC免疫分型根据肿瘤和间质室的组成不同描述了HNSCC的免疫景观，总结出三种免疫亚型：非免疫亚型、免疫衰竭亚型和免疫激活亚型。从图4A中可以发现，非免疫样本的比例在IRGPI两组之间几乎是均等的，但是在IRGPI-high组相较于IRGPI-low组，免疫活性样本较多，免疫衰竭样本较少。然后将203个免疫样本按pan-SCC免疫亚型进一步分类。如图4B所示，其中IRGPI-low组中IS1和IS5亚型较多，IRGPI-high组中IS4亚型较多。

在大规模的HNSCC基因组分析研究中，有四种不同的分子亚型经常被报道，即atypical、basal、classical和mesenchymal。接下来着重研究了IRGPI组中分子亚型的分布。发现IRGPI-low亚组包括16%的atypical型样本，22%的basal型样本，19%的classical型样本和43%的mesenchymal型样本，而IRGPI-high亚组包括36%的atypical型样本，37%的basal型样本，15%的classical型样本和13%的mesenchymal型样本（图4C）。classical型在两组间几乎均匀分布，但IRGPI-high亚组atypical型和basal型样本多于IRGPI-low亚组，mesenchymal型较少。

06

不同IRGPI分型的ICI治疗疗效

接下来使用TIDE方法评估免疫治疗在不同IRGPI亚型中的潜在临床疗效。TIDE预测得分越高，表示免疫逃避的可能性越高，提示患者从ICI治疗中获益的可能性越小。结果发现IRGPI-high组的TIDE评分低于IRGPI-low组，说明IRGPI-high患者比IRGPI-low患者更能从ICI治疗中获益（图5A）。TIDE预测得分越高，预后结果越差。因此认为IRGPI-high组可能比IRGPI-low组有更好的预后。同时，发现IRGPI-high亚组有较高的微卫星不稳定性（MSI）评分，而IRGPI-low亚组有较高的T细胞exclusion评分，但在T细胞功能障碍方面两亚组无差异。此外，还评估了anti-PD-L1 治疗的两组UC患者中IRGPI的预后价值。从图5B和图5C可以看出，IRGPI-high患者比IRGPI-low患者的OS更好。还发现，TIDE在Alexandra et al’s UC 样本和Mariathasan et al’s UC 样本中的表现不一致（图E），TIS组在12个月和18个月的随访中AUCs更好，IRGPI组在18个月和24个月的随访中AUCs更好。因此，认为在两个组中，IRGPI对OS的预测价值与18-gene T-cell-inflamed signature （TIS）和TIDE相当。

小编总结

这个工作首先是通过对肿瘤和正常样本进行差异表达分析，与免疫相关基因做交叠，然后用这些基因进行WGCNA分析，识别与HNSCC相关的模块和基因。然后通过COX回归构建免疫相关基因预后指数（IRGPI）。然后对 IRGPI的分子和免疫结构进行了表征，检测了其在免疫治疗患者中的预后能力，并与其他生物标志物TIDE和TIS进行了比较。结果显示，对于接受传统治疗和免疫治疗的患者，IRGPI是一个有前景的预后生物标志物。