【高分新文】Cancer Cell|肾癌的分型与免疫检查点和血管生成阻断关联分析

Molecular Subsets in Renal Cancer Determine Outcome to Checkpoint and Angiogenesis Blockade

2020.10.28

IF:26.602

导语

GUIDE ╲

2018年，全世界有40多万人诊断出肾细胞癌（RCC），约17.5万人死亡。约25%的患者在初次诊断时出现转移性疾病。透明细胞癌（ccRCC）是肾细胞癌中最常见的组织学亚型（75%）。晚期肾细胞癌患者约20%的肿瘤含有肉瘤样成分。含有肉瘤样成分的肾细胞癌具有高度的侵袭性，会导致快速的转移和不良的临床预后。

背景介绍

ccRCC的主要特征是3p染色体的缺失、突变和/或启动子甲基化导致VHL基因功能失活，进而导致缺氧诱导因子（HIF）异常积累和血管生成程序激活。然而，VHL本身的损失不足以导致肿瘤的发生。一些其他的基因组畸变，如3p相关基因PBRM1、SETD2和BAP1的突变；9p21位点的局灶或arm-level缺失导致CDKN2A和CDKN2B基因缺失；KDM5C、TP53、MTOR或PTEN的改变与疾病进展和侵袭程度有关。ccRCC也是一种高度炎症的肿瘤类型，在泛癌分析中具有最高的免疫浸润分数，免疫检查点如PD-L1和CTLA-高表达。

考虑到ccRCC中不同但易变的高血管密度、免疫细胞浸润和PD- L1表达，使用血管内皮生长因子（VEGF）通路和PD-(L)1 axis抑制剂单独治疗或联合治疗可显著改善晚期肾细胞癌患者的临床疗效。然而，部分患者对该治疗不响应，这些治疗会产生明显的毒性。因此，需要更好地理解晚期肾细胞癌患者临床异质性的分子基础，以提供治疗选择策略和描述耐药机制。

本工作对来自一项随机的全局III期临床试验（IMmotion151）的823例晚期肾细胞癌患者样本（包括134例具有肉瘤样特征的肿瘤样本）进行整合多组学分析，确定了稳健分子亚型。这些分型与抗血管生成药物（贝伐珠单抗bevacizumab，anti-VEGF）和检查点抑制剂（CPI;阿特珠单抗atezolizumab或抗anti-PD-L1）与VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂（舒尼替尼sunitinib）比较。研究中获得的生物学和临床见解可能会为个性化治疗提供生物标志物策略，并指导肾细胞癌和其他癌症的未来治疗发展。

数据介绍

1. IMmotion151 （NCT02420821）

IMmotion151 （NCT02420821）是一项对曾接受治疗的晚期肾细胞癌患者的阿特珠单抗+贝伐珠单抗（n=454）相比舒尼替尼（n=461）用药的多中心、开放标签、3期随机对照试验。823/915（90%）患者的治疗前肿瘤通过RNA-seq进行了转录分析包括198例转移性肿瘤和625例原发肿瘤。其中，688例肿瘤组织学为透明细胞无肉瘤样成分，110例透明细胞有肉瘤样成分，1例透明细胞未知无肉瘤样成分，24例非透明细胞有肉瘤样成分。

2.FoundationOne试验

使用FoundationOne试验（Foundation Medicine, MA）对715名患者的治疗前肿瘤进行体细胞突变和改变评估。总的来说，702名患者的肿瘤进行RNA-seq和FoundationOne分析，代表了迄今为止在未治疗的晚期肾细胞癌随机试验中最大的基因组生物标志物数据集。

3. 随机II期试验（IMmotion150）中收集的肿瘤中对分子分类进行了验证。

4. Molecular Signatures Database （MSigDb）的hallmark基因集。

方法介绍

1. PD-L1免疫组化和评分

免疫组织化学采用SP142法（Ventana, AZ）检测PD-L1的表达。

2. T-effector和血管生成基因特征阈值的定义和验证

对于每个样本，使用来自McDermott et al., 2018的T-effector和血管生成特征形成的转录特征评分，在不同基因表达评分下计算危险比。在IMmotion150中，根据发生率和风险比稳定水平的结合，定义T-effector和血管生成特征的基因表达评分区间为2.93（40%发生率）和5.82（50%发生率）。拟合COX比例风险回归模型来比较阿特珠单抗+贝伐珠单抗或舒尼替尼治疗的患者在基因表达高亚群和低亚群中的PFS。

3. 非负矩阵分解（NMF）

使用中位绝对偏差（MAD）分析，选择了肿瘤中变异度最高的3072个基因（top10%）。然后通过使用一致性NMF聚类将表达数据的维度从数千个基因减少到几个元基因来计算子类。该方法对表达式矩阵进行多k因子分解，并利用同因子系数来评价解的稳定性。使用3072个变异度最高基因选择和测试k=2到k=8的823例患者肿瘤的最稳健的一致NMF聚类确定为k=7。

4. IMmotion150中NMF聚类的验证

为了验证从IMmotion151中得到的分子亚型，使用随机森林机器学习算法（R包randomForest）构建一个分类器，然后在一个独立数据集（IMmotion150）中预测NMF聚类。首先，限制了基因表达矩阵测试和训练集的top 10%变量基因IMmotion151 （n = 3072），将每个集合中的基因表达值归一化（z-score transform），以确保测试集和训练集在相同的尺度上。最后，在IMmotion151的训练数据上学习了随机森林分类器，并利用分类器对IMmotion150中的NMF类进行了预测。随后，评估了IMmotion151（图1C）中NMF类中基因表达特征的表达情况（IMmotion150）。

5. 基因表达定量集分析（QuSAGE）

为了理解NMF聚类的生物通路，进行了QuSAGE分析，将每个聚类与所有其他聚类进行比较，利用MSigDb标志基因集确定每个聚类中的富集通路。富集scores由热图展示（图1B）

6. 基因特征和分数

特征分数计算为每个样本的每个特征中包含的基因的中位数z分数。按照患者组进行汇总，如图1D所示，log2转换后的表达数据首先由患者组使用平均值进行汇总，然后转换为组z-score。

7. 定量和统计分析

除非另有说明，所有连续变量的两组比较使用双侧Mann-Whitney检验，超过两组的使用Kruskal-Wallis检验。配对比较使用带有Benjamini-Hochberg多重检验校正的Dunn’s post-hoc检验。对于分类变量，采用连续性校正的 Pearson’s Chi-squared检验。生存分析使用COX比例风险模型。

结果解析

01

患者样本、生物标志物收集和初始生物标志物验证

IMmotion151的研究设计和主要临床结果此前已有报道。823/915（90%）患者的Baseline肿瘤可用于生物标志物评估，这一亚群包括625例原发肿瘤和198例转移性肿瘤。评估了生物标志物与客观反应（OR）和无进展生存（PFS）之间的关系。

先前在试验immo150试验中报道了血管生成和T-effector基因表达特征与阿特珠单抗+贝伐单抗或舒尼替尼治疗的临床结果之间的关系。通过预先确定 IMmotion150中两种固定特征的转录cutoffs，并在IMmotion151中回顾性地应用它们来定义高表达和低表达患者亚群，评估了这些特征与临床结果的关联。支持IMmotion150的观察结果，在舒尼替尼治疗组中，血管生成特征的高表达与PFS的改善相关。在跨治疗组的比较中，在血管生成低或T-effector低的肿瘤中观察到无进展生存期差异。与舒尼替尼相比，阿特珠单抗+贝伐珠单抗改善了血管生成高或T-effector低的肿瘤患者的PFS。这些发现强调了免疫和血管生成生物学作为独立晚期RCC样本中检查点和血管生成阻滞对临床结果的区别的重复生物标志物的相关性。

02

7种ccRCC肿瘤分子亚型的识别和特征分析

为了加深对RCC生物学的理解，下一步基于IMmotion151 RNA-seq数据集，利用非负矩阵分解（NMF），以一种unbiased的方式进一步识别和细化转录定义的患者亚群。NMF基于IMmotion151样本中最易变基因前10%（3074）的人群确定了7组患者（图1A）。

为了了解驱动这些聚类的主要生物学特征，利用MSigDb的hallmark基因集，结合之前描述的血管生成、T-effector和Myeloid Inflammation特征，使用基因表达定量集分析（QuSAGE）将它们单独与所有其他集群进行比较（图1B）。为了总结这些pathway-level的分析并进一步细化discriminatory转录组谱，推导出了与Cell Cycle、Stroma、Complement Cascade、small nucleolar RNAs （snoRNAs）和代谢相关通路（包括脂肪酸）以及生物氧化通路，补充了最初的T-effector，血管生成和Myeloid Inflammation特征。这些转录程序在基因（图1C）和特征水平（图1D）的患者类中进行了总结。此外，应用xCell来推断肿瘤转录组中免疫细胞和间质细胞类型的相对频率。

NMF-derived的肿瘤类1和2主要表现为高度血管生成，血管和VEGF通路相关基因富集（图1B-D），以及推断存在内皮细胞。这些类也表现出转化生长因子b、WNT、hedgehog和NOTCH信号模块的高表达（图1B）。将类1标记为Angiogenic/Stromal，类2标记为Angiogenic。类3肿瘤的特点是血管生成和免疫基因表达相对较低，细胞周期基因表达中等，把这个类3标记为Complement/U-oxidation类。类4、类5和类6肿瘤的特征是富集细胞周期转录程序（G2M, E2F靶点，MYC靶点）和血管生成相关基因的低表达。根据相关性分析，观察到在类1和2中富集的血管生成特征和在类4、5和6中富集的细胞周期特征（包括细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK4和CDK6）之间相互排斥。类4、5和6也表现出合成代谢的转录组特征，与FAS （FASN、PARP1和ACACA）和戊糖磷酸通路（TKT、TALDO1和PGD）相关的基因的高的表达，这可能与这些肿瘤的增殖性质有关。类4中的肿瘤具有高免疫原性的特征，强烈的T-effector、JAK/STAT和interferon-a和-ɣ 基因表达模块富集（图1 B和C）。免疫组化（IHC）显示PD-L1表达最高（图1E），适应性和固有免疫细胞亚群浸润最高。相比之下，尽管基于xCell推测，类5和类6中的肿瘤显示了Myeloid Inflammation基因特征和先天免疫细胞富集，但显示了存在T-effector基因特征的低表达和推断的T细胞。FAS/戊糖磷酸通路相关基因表达在类5中最高。类5包含15例含有TFE融合的肿瘤，与mTORC1信号转导、细胞周期蛋白上调、代谢通路失调和肿瘤侵袭性增强有关。类6显示了上皮-间充质转化（EMT）转录模块的高表达以及胶原蛋白和纤维母细胞相关基质基因的富集。将类4命名为T-effector/Proliferative，集群5命名为Proliferative，集群6命名为Stromal/Proliferative。最后，类7的特征是富集了snoRNAs表达，尤其是C/D box snoRNAs（SNORDs）。SNORDs参与了表观遗传和翻译程序的改变，并与致癌作用有关。过表达SNORDs在RCC肿瘤中的确切作用仍有待确定，将类7命名为snoRNA类。

考虑到IMmotion151中的肿瘤既包括原发灶，也包括转移灶，评估了7个NMF亚群中每种肿瘤的发生率。转移性肿瘤分布在所有的集群中，说明转录分层方案并不是主要由肿瘤的原发或转移起源驱动的。接下来根据IMmotion151中的RNA-seq数据训练了一个随机森林分类器，并在IMmotion150随机II期试验中预测了患者肿瘤的NMF类。观察到的NMF类的分布以及这些类在IMmotion150中的转录表达谱与IMmotion151中的高度一致，证实了这些分子亚型的稳健性。

03

RCC分子亚型与预后风险分类和用药的预临床结局的差异相关

纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）和国际转移性肾细胞癌数据库联盟（IMDC）的模型经常用于晚期肾细胞癌患者的预后预测。这些模型利用临床和实验室参数将患者分为有利风险favorable-risk、中等风险intermediate-risk和不利风险poor-risk三类。然而，与这些风险类别相关的肿瘤的分子特征尚不完全清楚。接下来评估了NMF分子类在MSKCC和IMDC风险分类中的分布，发现Angiogenic/Stromal （no. 1）和 Angiogenic （no. 2）两种分类中在有favorable-risk组的聚集。相反，T-effector/Proliferative （no. 4）、Proliferative （no. 5）和Stromal/Proliferative （no. 6）在poor-risk组聚集（图2A）。

随后，评估了每类中阿特珠单抗+贝伐单抗和舒尼替尼治疗的临床结果。Angiogenic/Stromal （no. 1）和Angiogenic （no. 2） 治疗组中，均表现出更长的无进展生存期，表明无论采用何种治疗，结果都更好，而Stromal/Proliferative cluster （no. 5） 组的无进展生存期相对较短，表明增殖/基质生物学与临床差的预后相关（图2B）。

当对跨治疗组进行评估时，阿特珠单抗 +贝伐单抗和舒尼替尼组在Angiogenic/Stromal （no. 1）、Angiogenic （no. 2）和Complement/U-oxidation （no. 3）类的临床结局没有明显差异（图2C和2D）。在 T-effector/Proliferative cluster （no. 4）中，证明相比舒尼替尼，阿特珠单抗+贝伐珠单抗改善OR或PFS（图2C和2D），确认了先前存在的瘤内适应性免疫在确定含免疫治疗方案的获益方面的贡献。此外，在Proliferative cluster （no. 5）中，阿特珠单抗+贝伐单抗表现ORR（图2C）和PFS （图2D）改善，包括包含TFE融合的肿瘤，表明PD-L1阻滞在低血管生成但高增殖亚组中的相关性。在snoRNA cluster （no. 7）中，阿特珠单抗+贝伐珠单抗也能改善PFS，然而在这一小群患者中这种效应的生物学基础仍有待阐明。

随后，将只测试每个NMF类治疗组的单变量Cox比例风险模型获得的HRs与包括治疗组、PD-L1 IHC和MSKCC临床风险评分模型进行比较。这些多变量分析证实，在这些NMF群中观察到的差异临床获益与PDL1表达和MSKCC预后风险无关。

最后，评估了治疗组内和跨治疗组内响应者（包括完全响应或部分响应）和无响应者（进展性疾病）之间的差异表达基因。在接受舒尼替尼治疗的患者中，线性模型结合MSigDb标志基因集富集分析显示，有响应者的肿瘤中VEGF通路相关基因表达更高，无响应者肿瘤中细胞周期相关通路表达更高。阿特珠单抗+贝伐珠单抗治疗响应者与非响应者的基因表达比较未发现任何有显著差异的基因。在所有治疗组的响应者中，阿特珠单抗+贝伐单抗响应的患者中与增殖和免疫通路相关的基因富集，而与VEGF信号（缺氧）相关的基因富集在舒尼替尼响应的患者中。阿特珠单抗+贝伐单抗治疗无响应者与舒尼替尼治疗无差异表达基因。这些数据证实并支持NMF分类的结果。

04

体细胞的改变与肿瘤的内在和外在转录谱有关

接下来通过对715名患者肿瘤中体细胞改变的评估来补充转录谱分析。该样本群中体细胞改变的模式和出现程度与先前RCC肿瘤中反复发生的基因改变的报道大体一致（图3A）。先前的研究表明，原发性肿瘤和转移性肿瘤之间存在差异，与原发性肿瘤相比，转移性病灶中9p21.3染色体丢失的增加。在IMmotion151样本中，虽然在转移性肿瘤中完全改变了基因组，但12个基因的基因组改变频率与原发肿瘤相比在转移性肿瘤中增加。

接下来进一步分析了每个NMF类中 top改变基因的prevalence（图3B）。通过分析类分布的突变状态时，Angiogenic cluster （no. 2）在PBRM1和KDM5C突变体中富集，Proliferative （no. 5） 和Stromal/Proliferative （no. 6）在 CDKN2A/B 变异富集（图3C）。随后评估了存在于至少10%肿瘤中的体细胞改变与上述所讨论的转录组特征的关联（图3D）。与非突变体相比，PBRM1或KDM5C突变的肿瘤表现出更高的血管生成和FAO/AMPK相关基因特征的表达，细胞周期基因特征的表达减少。总的来说，体细胞改变谱说明了晚期肾细胞癌不同转录组谱的遗传基础。PBRM1和/或KDM5C的功能缺失与以血管生成特征为代表的亚型相关，而肿瘤抑制基因的功能缺失，包括CDKN2A/B和TP53，与高增殖、合成代谢和基质生物学相关（图3D）。

05

体细胞变异与临床结局之间的关系

对体细胞改变亚组临床结果的评估显示，无论治疗方法如何，PBRM1突变总体预后较好（图4A）。用舒尼替尼治疗的PBRM1突变的肿瘤患者与非突变的PBRM1患者相比，PFS更长。在阿特珠单抗+贝伐单抗治疗的患者中也观察到PBRM1突变型肿瘤中PFS延长的趋势，但没有达到统计学意义。在不同治疗组的比较中，PBRM1突变的肿瘤的PFS或ORR没有差异。具有PBRM1非突变性肿瘤的患者，相比对舒尼替尼，阿特珠单抗+贝伐单抗可改善PFS（图4A）和ORR（图4B）。

相反，与未改变的肿瘤相比，CDKN2A/B改变预后更差（图4A和4C）。各治疗组相比，阿特珠单抗+贝伐单抗的CDKN2A/B改变的肿瘤患者无进展生存期更长（图4A），ORR更高（图4B）。分析表明，存在ARID1A和/或KMT2C功能缺失突变的肿瘤患者在使用阿特珠单抗+贝伐单抗治疗时，PFS明显优于舒尼替尼（图4A-B）。总的来说，该工作发现了5个与阿特珠单抗+贝伐单抗vs舒尼替尼临床结果相关的频繁功能改变的基因，表明晚期RCC的靶向体细胞突变谱可以帮助指导治疗选择。

06

肉瘤样RCC肿瘤的分子特征

包含肉瘤样成分（sRCC）的RCC肿瘤预后差，对VEGF通路抑制剂的标准治疗反应有限。因此，随后分析了sRCC肿瘤的分子特征，将其与非肉瘤样RCC （non-sRCC）肿瘤区分开来。与non-sRCC肿瘤相比，DGE分析发现sRCC中有2917个过表达基因和6309个低表达基因（图5A）。基因集富集分析显示sRCC中参与细胞周期/增殖的转录通路和免疫应答富集，VEGF通路相关基因低表达（图5B）。接下来进一步比较了sRCC和non-sRCC肿瘤在NMF类中的分布，观察到sRCC肿瘤富集于T-effector/Proliferative （no. 4）、Proliferative （no. 5）和Stromal/Proliferative （no. 6）类，较少富集于Angiogenic/Stromal （no. 1）和Angiogenic （no. 2） 类（图5C）。此外，基因表达特征的评估证实，与non-sRCC肿瘤相比，sRCC肿瘤中血管生成和FAO/AMPK特征表达较低，细胞周期、基质、T-effector和Myeloid Inflammation特征表达较高（图5D）。相比于non-sRCC，sRCC中PD-L1蛋白质出现频率明显高（图5 E），基因表达分析证明interferon-ɣ响应增加，反映sRCC中的interferon-ɣ上调PD-L1。

体细胞变异分析显示，在sRCC中PBRM1突变的发生率较低，说明在这些肿瘤中观察到的低血管生成基因表达的基因组基础。相反，在sRCC中CDKN2A/B的发生率和PTEN的改变明显更高，这表明这些基因的体细胞功能丧失可能有助于肉瘤样肿瘤的侵袭性表型（图5F）。

考虑到ccRCC和非ccRCC在病因学上的差异，比较了ccRCC非肉瘤样肿瘤（ccRCC- nonsarc）、ccRCC- sarc和非ccRCC- sarc的分子特征。与ccRCC-NonSarc肿瘤相比，ccRCC-Sarc肿瘤显示与细胞周期/增殖和免疫应答相关的通路富集，与血管生成和缺氧相关的基因表达较低。证实了整体肉瘤样亚群（sRCC）中血管生成通路的下调主要不是由non-ccRCCSarc肿瘤驱动的。

对两组肉瘤样肿瘤（ccRCC-Sarc vs non-ccRCC-Sarc）的DGE分析显示，ccRCC-Sarc肿瘤中VEGF通路相关基因（缺氧）表达上调，而非ccRCC-Sarc肿瘤中细胞周期/增殖通路（G2M、E2F靶点、EMT、MYC靶点）表达上调。与ccRCC-NonSarc肿瘤相比，PD-L1在ccRCC-Sarc和non-ccRCC-Sarc肿瘤中均表达富集。对比NMF类在组织亚型中的分布，发现ccRCC-Sarc肿瘤富集在T-effector/Proliferative （no. 4） 和Stromal/Proliferative （no. 5）类，non-ccRCC-Sarc肿瘤富集在Proliferative （no. 5） 和Stromal/Proliferative （no. 6） 类。

通过对三种组织学亚型的体细胞改变的评估，证实了先前研究报道的ccRCC亚型中VHL突变的高发生率。与ccRCC-NonSarc相比，ccRCC-Sarc和non-ccRCC-Sarc肿瘤中PBRM1比CDKN2A/B突变的发生率更低，PTEN突变的发生率更高。BAP1突变在ccRCC-Sarc中发生率最高，而non-ccRCC-Sarc在TP53和RB1变异中富集。

总的来说，本工作的分析显示，sRCC肿瘤表现出高度增殖的分子表型，其特征是血管生成相对较低，并伴有较高的免疫存在和PD-L1表达，这可能解释了阿特珠单抗+贝伐单抗与舒尼替尼治疗干预对肉瘤样肿瘤敏感性增加的原因（图5G和5H）。

小编总结

本工作对III期临床试验IMmotion151的823例晚期肾细胞癌患者样本进行整合多组学分析，利用非负矩阵分解方法确定了7类稳健分子亚型，并在II期试验IMmotion150中验证分子分型。然后分析了这些分型的生物学特征，以及与预后风险相关性评估。这些分型与抗血管生成药物贝伐珠单抗和检查点抑制剂阿特珠单抗或抗anti-PD-L1与VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼进行比较。对FoundationOne试验样本的体细胞改变谱分析说明了晚期肾细胞癌不同转录组谱的遗传基础。

引用：

Motzer RJ, Banchereau R, Hamidi H, Powles T, McDermott D, Atkins MB, Escudier B, Liu LF, Leng N, Abbas AR, Fan J, Koeppen H, Lin J, Carroll S, Hashimoto K, Mariathasan S, Green M, Tayama D, Hegde PS, Schiff C, Huseni MA, Rini B. Molecular Subsets in Renal Cancer Determine Outcome to Checkpoint and Angiogenesis Blockade. Cancer Cell. 2020 Oct 28:S1535-6108(20)30542-0. doi: 10.1016/j.ccell.2020.10.011. Epub ahead of print. PMID: 33157048.