7分+纯生信思路，看到后我又跃跃欲试了

前面一期我们讲了一篇非肿瘤相关的数据挖掘，研究了3种m6A调节因子介导的RNA甲基化修饰模式与牙周炎免疫微环境调控之间的关系，拯救非肿瘤：m6A+免疫微环境+5分+纯生信思路，你确定不来看看？

今天带来的是2021年12月14日发表在Front Immunol上的一篇研究，文章主要探讨了2种CD8+T细胞相关分子亚型的异质性免疫组学特征，以及在肾透明细胞癌(ccRCC)中的临床意义。这是以单个肿瘤中的某种细胞，找相关的基因，从而进行后续的分析。同样地，我们可以试想采用这个思路去研究与其他免疫细胞密切相关的基因组，不妨试一试吧~

Front Immunol.doi: 10.3389/fimmu.2021.745945.

PMID: 34970257; PMCID: PMC8713701.

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期刊简介

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文献解读

简介

肿瘤微环境(TME)在肿瘤生物学和免疫治疗领域有着重要的影响。TME中 CD8+T 细胞的异质表型和临床意义尚未完全阐明。

在这项研究中，作者基于多组学数据对免疫基因组进行分析，探讨了CD8+T细胞相关分子亚型的临床价值和肿瘤异质性。首先，作者在TCGA数据集中发现了两个不同的ccRCC分子亚型(C1和C2)，并在E-MTAB1980队列中进行了验证。

其中C1亚型提示预后不良，其中CD8+T细胞耗竭标记物表达水平升高，免疫浸润水平升高，存在免疫逃逸机制。C2亚型提示预后良好，其中CD8+T细胞效应标记物表达水平升高，存在低频率的9p21.3缺失和高频率的PBRM1突变。紧接着，研究者在CheckMate025队列中，检测这两种分型对抗PD-1（Nivolumab）治疗效果的影响，结果表明C2亚型的治疗效果好于C1亚型。

总之，该研究确定了ccRCC中两个CD8+T细胞相关的分子亚型，为评估CD8+T细胞的潜在功能提供了新的见解，是ccRCC患者预后预测和免疫治疗知道的潜在策略.

01.研究流程

02.研究方法

1.数据来源

• TCGA数据库：下载 ccRCC (n = 539) 和正常 (n = 72) 组织样本的 RNA 测序数据；
• cBioportal数据库：下载相应的临床数据；
• ArrayExpress网站：下载E-MTAB-1980队列的基因表达谱和临床信息的矩阵文件。
• 从已发表文献中收集接受Nivolumab（抗PD-1）治疗的ccRCC患者的CheckMate 025 (CM-025)队列的标准化转录组和临床数据。

2.免疫相关基因的差异分析

• InnateDB网站：获得免疫相关基因（7399个）。
• TCGA队列中ccRCC(n=539)和正常组织(n=72)样本：获得差异表达基因(DEGs)5640个；
• 将免疫相关基因与DEGs相交获得免疫相关差异表达基因（IRDEGs）。

3、TME中免疫/非免疫细胞的收集和生存分析

• xCell网站：下载TME 中64种免疫和非免疫细胞类型；
• Cox回归和Kaplan-Meier分析识别与预后相关的免疫和基质细胞类型。

4.IRDEG的加权相关网络分析（WGCNA）

• 对获得的免疫相关差异表达基因（IRDEGs）进行WGCNA.

5.无监督聚类分析

• Kaplan-Meier和单变量Cox回归分析从棕色模块中选择基因进行无监督聚类分析；
• 基于上述基因执行共识非负矩阵分解（CNMF）算法；
• 对 E-MTAB-1980 队列进行了相同的分类程序以验证分子分类。

6.分子亚型的预后价值

• COX回归分析和ROC分析评估TCGA队列中分子亚型的预后价值.

7.体细胞突变和拷贝数改变（CNA）数据获取

• cBioportal 网站：下载体细胞突变和 CNA 数据.

8.免疫基因组特征采集

• 检索免疫相关特征：肿瘤突变负荷(TMB)、新抗原负荷、同源重组缺陷(HRD)、CTA评分和肿瘤内异质性(ITH)在内的免疫相关特征。

9.ssGSEA和功能富集分析

10.基因组变异分析（GSVA）

• GSVA 来识别不同亚型之间 KEGG 通路的差异。

11.基因分类系统的构建和验证

• NTP算法构建基因分类系统；生成PIE分类系统（ccRCC预后和ICB治疗效果）；
• 基因分类器在 E-MTAB-1980 和 CM-025 队列中得到验证，并与之前基于 CNMF 算法的分子分类进行比较。

03.研究结果

1.在 ccRCC 中识别 IRDEG

• 图B：火山图用于可视化 TCGA 中 ccRCC 和正常组织样本之间的免疫相关差异表达基因 (IRDEG)
• 图C：DEGs 和 InnateDB 免疫相关基因的交集，共获得了 1399 个IRDEGs

2.64中免疫和非免疫细胞类型的生存分析

• Kaplan-Meier 和 Cox 回归分析表明，21 种细胞类型与 ccRCC 的总体存活率相关；
• 高丰度 CD8 +T 细胞与较差的预后相关。

CD8 + T 细胞的 Kaplan-Meier 分析

3.IRDEGs的加权基因相关网络分析

• CD8+T细胞相关基因模块的鉴定

图B：IRDEG的聚类树状图。颜色强度与CD8+T细胞的丰度呈正相关。在生存状态方面，红色表示死亡，白色代表存活；

图C-D：分别显示对各种软阈值能力的无标度拟合指数和平均连通性的分析；

图E：模块特征基因的聚类，红线显示切割高度(0.25)；

图F：基于相异性度量(1-TOM)聚类的稳健IRDEG的树状图；

图G：模块特征基因与ccRCC临床特征相关性的热图；

图H：与棕色模块中CD8+T细胞丰度相关的模块特征基因散点图。

4.CD8+T细胞的异质表型/CD8 + T 细胞的潜在生物学功能

• 将TCGA 队列分为两组，高 CD8 + T 细胞浸润组和低 CD8 + T 细胞浸润组。
• 高 CD8 + T 细胞浸润组：关键免疫检查点基因的表达水平升高，CD107a表达水平较低，免疫抑制评分和免疫抑制细胞（M2巨噬细胞和Th2细胞）丰度较高；
• 低 CD8 + T 细胞浸润组：与代谢途径以及WNT信号通路和TGF-β信号通路有关

图A：CD8+T细胞相关基因的功能富集分析结果；

图B：高CD8+T细胞浸润组和低CD8+T细胞浸润组之间的基因集变异分析（GSVA）。

图C-D：高CD8+T细胞浸润组和低CD8+T细胞浸润组之间免疫相关特征的差异。其中高CD8+T细胞浸润组的关键免疫检查点基因的表达水平升高；

图E：高CD8+T细胞浸润组和低CD8+T细胞浸润组中免疫抑制细胞的丰度。

5.分子分类的构建及临床意义分析

• TCGA队列中分子分类的构建及临床意义分析：分子亚型比ClearCode34分类更能精准预测 ccRCC预后；
• 单变量cox回归分析、Kaplan-Meier分析筛选出与预后相关的棕色基因；
• CNMF 算法进行分子分类，Cluster1和Cluster2；
• Cluster1：预后差；热图显示其与更高的组织学分级、T阶段、N状态、M阶段和分期相关
• Cluster2：预后好；

图A：Kaplan-Meier分析，C1低于C2。

图B：确定最佳聚类数为2个。

图C：两个亚型的基因表达差异。

图D：两个亚型的相关基因热图；

图E-F：TCGA 队列中单变量(E)和多变量(F) Cox 回归分析的Forrest 图。提示分型是ccRCC总生存期的独立预后因素。

图G：DCA表明：分子亚型比ClearCode34分类更能精准预测预后。

图H：桑基图表明：分子亚型、ClearCode34分类和临床特征之间的相关性。

6.E-MTAB-1980 队列中分子分类的验证

• C1 和 C2 的 IGP 值分别为 89.5% 和 98.4%，表明这两个分子亚型在 E-MTAB-1980 队列中具有高度的可重复性。

图A: Kaplan-Meier 分析显示，Cluster1 患者的预后明显低于 Cluster2 患者。

图B:接近 1 的轮廓系数表明该样本与相邻聚类不同，并确定最佳聚类数为两个。

图C:差异表达测试了两个簇之间的表达差异。

7.两个分子亚型之间生物学机制的差异

• GSVA：两个分子亚型都显着富集了代谢相关途径
• C1：与原发性免疫缺陷、核苷酸代谢、JAK-STAT 信号传导、Toll 样受体信号传导、血管内皮生长因子 (VEGF) 信号传导、hedgehog 信号传导、p53 信号传导和细胞周期/凋亡相关通路相关的基因组在 C1 簇中显着升高. 可能通过多种免疫抑制途径发生癌症免疫逃逸。
• C2 ：在氨基酸代谢（例如酪氨酸和谷氨酸代谢）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 信号传导、转化生长因子 (TGF)-β 信号传导、胰岛素信号传导、过氧化物酶体增殖物激活受体中显着富集(PPAR) 信号传导和紧密连接通路，这些途径可能会改变与癌症相关的免疫微环境。

8.分子亚型中的外在免疫逃逸机制

• C1亚型：具有较高的免疫浸润和免疫抑制评分。
• C2亚型：具有较高的GZMB/CD8A比率（抗肿瘤免疫功效的标志）

分子簇间外在免疫逃逸机制的探索。两个分子簇之间的免疫评分(A)和免疫抑制评分(B)的差异。(C) TMEM173 (STING)、IL10、IL10RA、TGFB3 和 TGFBI 在分子簇之间的表达差异。(D)肿瘤微环境中分子簇与免疫细胞和非免疫细胞的关系。(E)分子簇之间的 GZMB/CD8A 比率。(F)桑基图揭示分子簇与免疫亚型之间的相关性。（**** P < 0.0001；*** P < 0.001；* P < 0.05）。

9.分子亚型中的内在免疫逃逸机制

C1亚型表现出导致预后不良的内在免疫逃逸机制：

• 具有较高的TMB、新抗原负荷、HRD、CTA评分和ITH，表明它具有更多的肿瘤抗原来源。
• MHC I 相关抗原呈递基因表达水平较低。
• CD8+T细胞衰竭标志物的表达水平升高，包括 CTLA4、TIGIT、PDCD1 和 LAG3，并且脱粒标志物 (CD107a) 的水平受到抑制。

分子亚型间内在免疫逃逸机制探索。比较两个集群之间的肿瘤突变负荷 (TMB) (A)、新抗原负荷(B)、同源重组缺陷 (HRD) (C)、CTA 评分(D)和肿瘤内异质性 (ITH) (E)。(F)两个分子簇之间免疫调节剂的比较。(G)显示两个簇中免疫调节剂基因簇的热图。(**** P < 0.0001)。

10.分子亚型的基因组变化

• C1亚型：细胞周期和 TP53 相关通路在C1 中高度富集；
• C2亚型：Hippo、NRF2、PI3K、RAS 和 TGF-b 相关通路在 C2 中富集;
• 驱动基因突变、CNA分布：C1 集群中 BAP1、SETD2、TACC2、MTUS2、POLR2A、ZZEF1、APOB、MEGF10、RELN、NOTCH2、USH2A 和 PTEN 的突变比 C2 集群更频繁。

11.验证CM-025队列中的分型

• 在CM-025队列中，执行与TCGA和E-MTAB-1980队列相同的步骤验证分型，CM-025队列中CD8+T细胞相关基因识别和分子亚型具有高度重复性。
• Kaplan-Meier 分析：C2 表现出更好的 OS，并且往往具有比 C1 的 ICB 治疗反应率，表明 C2 亚型更有可能受益于抗 PD- 1治疗。

分子亚型与免疫检查点阻断疗法之间的关联。(A)两个分子簇之间驱动基因突变、拷贝数改变 (CNA) 的分布。(BD)根据 Check-mate 025 队列中的 CD8 + T 细胞相关基因鉴定和验证分子簇。(B) Kaplan-Meier 分析显示 Cluster1 患者的预后明显低于 Cluster2 患者。(C)轮廓系数表明该样本与相邻的集群区分开来。(D)差异表达测试了两个簇之间的表达差异。(五)在 C1 和 C2 集群中对 Nivolumab 免疫治疗有反应的患者比例。CR，完全响应；PR，部分响应；SD，疾病稳定；PD，进行性疾病。(F) C1 和 C2 簇中 9p21.3 缺失的患者比例。(G) C1 和 C2 簇中 PBRM1 突变的患者比例。

12.基因分类系统的构建和验证

• 为方便临床应用，采用NTP算法生成PIE分类系统（评估ccRCC预后和ICB治疗效果），PIE分类系统的预测结果与分子亚型具有高度的一致性；
• 对基因分类系统进行 Kaplan-Meier 分析，结果与原始分类一致。

（A） PIE分类器表达水平的热图。TCGA (B)、E-MTAB-1980 (C) Check-mate 025 (D)队列中分子簇预测的一致性，PIE 分类系统和基于 CNMF 算法的分子分类。

TCGA (A)、E-MTAB-1980 (B)和 CM-025 (C)群组的 PIE 分类系统的 Kaplan-Meier 分析。

好啦，今天就到这里啦，小编会继续找数据挖掘的新思路分享给大家，