容易复现！铁死亡+免疫相关亚型分析轻松可发7+！

导语

最近，在肺腺癌（LUAD）中发现了几种具有不同预后的分子亚型。然而，在 LUAD 中，铁死亡分子亚型的特征和相关的肿瘤微环境 (TME) 细胞浸润尚未得到充分研究。

背景介绍

铁死亡与免疫一直是生信分析的两大热点，所以当这两点结合后，便可轻松的做出不错的成果。今天小编为大家带来的这篇文章，作者使用 1160 个肺腺癌样本，探索了由铁死亡相关基因介导的分子亚型，以及相关的 TME 细胞浸润。文章发表在《Oncoimmunology》上，影响因子为：7.723，文章题目为：Molecular subtypes based on ferroptosis-related genes and tumor microenvironment infiltration characterization in lung adenocarcinoma。

数据介绍

本研究所使用数据来自 GEO 的五个数据集和 TCGA-LUAD 数据集。

技术路线

本研究技术路线如图所示。

结果解析

01

LUAD中铁死亡亚型的鉴定

本研究包括一个 LUAD 元队列（GSE30219、GSE37745、GSE50081、GSE68465、GSE72094），其中包含了患者的生存和临床信息。通过单因素 Cox 回归分析本研究在 1160 名 LUAD 患者中确定了 14 个与预后相关的铁死亡相关基因。

接下来，本研究将14个铁死亡基因构建成网络图谱，从而能够全面分析基因的相互作用和相互联系以及它们对LUAD患者预后的影响（图1a）。为了探索 LUAD 中铁死亡的分类，本研究使用无监督聚类分析对表达 14 个铁死亡相关基因表达的 1160 个 LUAD 样本进行了分析。从结果中，本研究确定了三个亚型，分别命名为为簇 A-C。 其中A组包括398例，B组包括412例，C组包括350例。

图 1

本研究通过生存分析发现，三种铁死亡亚型的预后存在显著差异，C 组具有相当大的生存优势（图 1b）。接下来，本研究通过主成分分析（PCA）进一步证实了三种显著不同的亚型（图 1c），并研究了三种亚型与各种临床特征之间的关系（图1d）。由于GSE72094数据集临床信息比较完整，样本量较大，因此被本研究用于验证聚类的可重复性。结果显示这三种亚型之间的生存率存在显著差异（图1e），进一步证明LUAD有三种亚型。

02

铁死亡亚型TME细胞浸润特征及生物学功能

为了更好地了解三个集群之间的生存差异，本研究首先对三种亚型进行 GSVA 富集分析，以检查它们的功能和生物学差异（图 2a，b）。结果表明，簇A主要富集于一些致癌通路，如P53、WNT、TGF BET信号通路；簇 B 主要与致癌通路和核苷酸修复和降解有关；簇C主要富集于免疫激活相关通路，如B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路以及抗原加工和呈递。

接下来，本研究使用 ssGSEA 分析在三个亚型中评估 28 种免疫细胞的富集评分（图 2c）。在簇 A 中，最显著的免疫浸润细胞是活化的 CD4+ T 细胞、活化的树突状细胞、中性粒细胞和浆细胞样树突状细胞。在C簇中，最显著的是巨噬细胞、中央记忆CD4T细胞、效应记忆CD8T细胞、嗜酸性粒细胞、未成熟B细胞和T-滤泡辅助细胞。B簇中的免疫细胞浸润水平介于A簇和C簇之间。综合分析三个铁死亡集群的 ESTIMATE 评分和免疫评分，发现 C 簇的得分最高。

图 2

接下来本研究进一步探讨三个簇间TME浸润细胞组成的差异。使用CIBERSORT算法计算每位患者22种免疫细胞的相对百分比（图2d）。对 1160 名 LUAD 患者的基质活性进行定量分析，正如预期的那样，A 簇中的 EMT2 和 Pan-F-TBRS 显著高于其他两个簇，而簇 C 与抗原加工机制和免疫检查点有关（图 2e）。

03

LUAD中铁死亡DEGs的综合分析

为了进一步探索铁死亡亚型在 LUAD 中的潜在生物学功能，本研究使用 limma R 包对三个簇之间的 DEGs 进行识别，共得到 470 个基因。接下来，GO 富集分析表明，大量富集的 DEGs 参与了 T 细胞增殖、自然杀伤细胞激活和自然杀伤细胞激活的正向调节，所有这些都是免疫反应的一部分（图 3a）。结果表明，这些DEGs与免疫相关的生物学过程密切相关，证实了铁死亡与免疫显著相关。

图 3

接下来本研究在 GSE72094 数据集中对 DEGs 进行聚类分析。结果与铁死亡的表型聚类相似，即鉴定了三个亚型，称为基因簇 AC（图 3b）。根据 DEGs 的表达水平，可以显著区分这三种亚型（图 3c）。 在GSE72094 队列中基因簇 AC 的存活率显著不同（图 3d），本研究使用冲积图来更好地可视化不同基因簇和铁死亡簇之间的存活差异（图 3e），结果显示，三个基因簇中 14 个铁死亡相关基因的表达存在显著差异（图 3f）。

04

铁死亡特征的构建

为了进一步了解每位 LUAD 患者的铁死亡特征，本研究采用 LASSO Cox 回归确定 λ 的最佳值，并确定了 13 个关键基因。然后根据13个关键基因的表达建立铁死亡预后模型，并将其定义为铁死亡评分。根据 8.97 的临界值，本研究将 1160 名 LUAD 患者分为高铁死亡评分（n = 679）组和低铁死亡评分（n = 481）组。

在所有 LUAD 队列中，高铁死亡评分的患者的存活率低于低铁死亡评分的患者，并且 Kaplan-Meier 生存曲线显示各组之间存在显著差异（图 4a）。在 GSE72094 队列中，高铁死亡评分和低铁死亡评分的组之间也存在明显的生存差异（图 4b）。ROC 曲线显示，铁死亡特征可有效预测 LUAD 患者的 5 年生存率（图 4c）。

图 4

接下来，本研究进一步探讨了铁死亡评分与铁死亡簇A-C和铁死亡基因簇A-C之间的关系。结果显示，C 簇与低铁死亡评分显著相关，表明低铁死亡评分可能与免疫激活有关。簇 A 和 B 与高铁死亡评分显著相关（图 4d），基因簇 A 与低铁死亡评分相关，这些患者预后较好。基因簇 B 和 C 与高铁死亡评分显著相关（图 4e）。这些结果表明，铁死亡评分可能与免疫相关，可能有助于预测 LUAD 中的铁死亡亚型。

接下来，本研究在高铁死亡评分组和低铁死亡评分组中进一步研究了 28 种免疫细胞浸润到 TME 中的情况。结果显示，各组间免疫细胞浸润有显著差异。在低铁死亡评分组中，参与肿瘤免疫激活的大多数免疫细胞的浸润较高（图 4f）。这一发现证实了低铁死亡评分与免疫激活相关的假设，具有该评分的患者存活率更高。

05

TCGA中铁死亡的特征

首先，本研究采用多因素 Cox 回归探讨铁死亡评分与临床特征的关系，结果表明分期和铁死亡评分可作为独立的预后因素（图 5a）。在 TCGA 队列中，高铁死亡评分和低铁死亡评分患者的存活率差异具有统计学意义（图 5b）。这再次验证了使用铁死亡评分来预测 LUAD 患者的预后。本研究使用 ROC 曲线评估的预测优势尤其反映在老年患者中（图 5c）。

图 5

接下来，本研究在 TCGA 队列中检查了铁死亡评分与免疫之间的关系。首先，比较高铁死亡评分和低铁死亡评分的体细胞突变，并可视化突变频率最高的前 20 个基因（图 5d，e）。结果显示高铁死亡评分组和低铁死亡评分组之间的肿瘤突变负荷没有显著差异。然后，研究了簇与免疫检查点相关分子之间的关系。结果显示PD1、PD-L1、PD-L2 和 CTLA-4 在低铁死亡评分组中具有更高的表达（图 5f）。

06

铁死亡评分与免疫治疗的关系

本研究为了进一步说明铁死亡评分与免疫治疗疗效之间的关系，研究了一个临床数据相对完整、样本量大的抗 PD1/PD-L1 治疗队列（imvigor210）。通过构建铁死亡特征，将 imvigor210 队列分为高铁死亡评分组和低铁死亡评分组，各组的预后显著不同（图6a）。铁死亡评分低的患者预后较好，这也提供了初步证据表明，铁死亡评分低的患者免疫治疗的结果优于铁死亡评分高的患者。

由于PD-L1的表达水平与抗PD-L1治疗的疗效密切相关，因此本研究分析了铁死亡评分与IC和TC免疫类型的关系（图6b，c，d），结果显示，IC2的铁死亡评分低于IC0和IC1；TC2 的铁死亡评分低于其他两组；免疫炎症型的铁死亡评分低于免疫沙漠型和免疫排斥型。

图 6

这些结果表明，铁死亡评分与 PD-L1 的表达水平呈负相关，低铁死亡评分与免疫炎症类型显著相关。此外，低铁死亡评分具有更好的 CR/PR 率和更低的 SD/PD 率（图 6e，f）。这些发现表明，铁死亡评分可用于预测免疫疗法的疗效。

小编总结

本研究检查了与铁死亡相关的基因在 LUAD 表型和 TME 中的综合作用并构建了与铁死亡相关的特征来预测 LUAD 中免疫治疗的铁死亡亚型、预后和效果。本研究发现，根据14个铁死亡相关基因的表达情况，LUAD可分为3个亚型，测试集证明了分类的可重复性，三种亚型的预后存在显著差异。本研究的限制在于需要大量的LUAD样本来验证分型的稳定性，而铁死亡与免疫的关系需要进一步的实验验证。总之，本研究为大家提供了一种将铁死亡与免疫结合起来进行分析的思路，值得大家学习借鉴！