8+！免疫相关：肝细胞癌中 T 细胞介导的肿瘤杀伤的分子特征

导语

尽管检查点阻断是治疗肝细胞癌 (HCC) 的一种有前途的方法，但尚未确定预期会出现反应的患者亚群。T 细胞介导的肿瘤杀伤 (TTK) 是免疫检查点抑制剂治疗的基本原理。

背景介绍

免疫相关分析一直是生信分析经久不衰的热点，今天小编为大家带来的这篇文章，作者通过高通量筛选试验鉴定了调节肿瘤细胞对 T 细胞介导的杀伤（GSTTKs）敏感的基因，应用无监督聚类根据 GSTTK 将 HCC 患者分类为亚型。文章发表在《Frontiers in Immunology》上，影响因子为8.786，文章题目为：Molecular Characteristics of T Cell-Mediated Tumor Killing in Hepatocellular Carcinoma。

数据介绍

本研究从TCGA，ICGC，GEO中共获得了660 个 HCC 样本数据集。从TISIDB获得与癌症免疫治疗中对 TTK 的良好反应相关的基因，用于建立基因组，称为 GSTTKs。

技术路线

本研究技术路线如图所示。

结果解析

01

参与HCC进展的GSTTKs的鉴定和表征

本研究使用 TCGA-LIHC 队列的多组数据对 GSTTKs 进行综合分析。转录组数据的差异分析结果表明，641 个 GSTTKs 中有 92 个在 HCC 中上调或下调（图 1A）。单变量 Cox 回归分析显示，641 个 GSTTKs 中有 125 个与 HCC 的预后有关。取两组基因的交集，37 个 GSTTKs 在 HCC 中同时表现出差异表达和预后价值（图 1B）。对 37 个 GSTTKs 的单变量 Cox 分析显示，11 个 GSTTKs 是 HR < 1 的保护因素，16 个 GSTTKs 是 HR > 1 的 HCC 预后危险因素（图 1C）。37 个 GSTTKs 的突变情况显示在图 1D 中的瀑布图中。

图 1

37 个 GSTTK 中有 18 个突变频率 > 1%，并且与 HCC 的进展或复发密切相关。本研究还在这 18 个 GSTTK 中检测到广泛的 CNV（图 1E）。其中拷贝数增加最为频繁，RECQL4、CAPN11、n d FGF12 显示出广泛的 CNV 扩增，而 H2AFZ 显示出拷贝数丢失。18 个带有 CNV 的 GSTTK 的染色体位置如图 1F 所示。基于这 18 个具有不同 mRNA 水平的 GSTTKs（图 1H），PCA 可以完全分离 HCC 和非肿瘤样本（图 1G），表明正常和 HCC 组织之间 GSTTKs 的突变状态和表达存在高度异质性。因此，GSTTK 表达变化可能在 HCC 的发生和进展中起关键作用。

02

HCC中的TTK模式

基于 TCGA-LIHC 的 RNA-seq 数据和临床数据，本研究确定了四种不同的模式，这些模式表明 18 种 GSTTKs 相互作用的综合景观及其对 HCC 患者的预后意义可以通过 18 种 GSTTKs 网络相关性来描述（图 2A）。使用无监督聚类确定了两种不同的修饰模式，包括146 例 Cluster1 和 203 例 Cluster2 （图 2B）。接下来本研究通过PCA算法和tSNE算法来评估两种TTK模式之间的差异，发现不同TTK模式之间的转录谱存在显著差异（图2C，D）。接下来本研究通过生存分析评估 TTK 模式在 HCC 患者中的临床预后价值，结果发现两个集群中的患者在 TCGA 数据集（图 2E）和 ICGC 数据集（图 2F）中的存活率均显示出显著差异。

图 2

03

不同TTK亚型患者免疫治疗反应的机制

通过比较两种 TTK 亚型之间 HCC 的 TME 中的浸润性免疫细胞组成（图 3A），本研究发现：1) 簇 1 中的样本大多表现出低免疫细胞浸润，而簇 2 中的样本大多表现出高免疫细胞浸润。2) 热图中的高免疫浸润区包含为介导抗肿瘤免疫反应而建立的免疫细胞和多种免疫抑制细胞，提示可能存在反馈机制，即 TME 可能促进免疫抑制细胞的募集或分化。

图 3

为了确定导致Cluster 1和Cluster 2之间TME差异的特定免疫成分，本研究计算了28个免疫细胞在不同亚型之间的差异。结合生存分析结果（图 2E），与有利生存结果相对应的簇 2 中的样本显示，效应记忆 CD8+ T 细胞、Th1 细胞、CD56 自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤 T 细胞、中性粒细胞和浆细胞样树突状细胞大量浸润（图 3B）。基于 RNA 测序数据的 TIDE 分析显示，Cluster 2 中的样本在 T 细胞功能障碍、微卫星不稳定性和肿瘤相关成纤维细胞方面的得分高于 Cluster 1 中的样本，而 Cluster 1 中的样本在 T 细胞排斥、骨髓细胞方面的得分更高；这些发现与 ssGSEA 结果大体一致（图 3C）。

04

肝癌中的TTK模式与代谢微环境

接下来本研究基于 GSVA 对 TCGA-LIHC 数据集进行了富集分析（图 4A），结果两个 TTK 簇在代谢通路方面存在显著差异，这表明代谢变化较大。接下来，本研究提取了糖酵解和胆固醇生成基因，并使用它们将 HCC 分为四种代谢亚型：静止、糖酵解、胆固醇生成和混合（图 4B），并检测到四个代谢簇之间的 OS 存在显著差异，静止和胆固醇生成亚型优于糖酵解和混合亚型（图 4C）。

图 4

为了研究跨糖酵解-胆固醇生成轴的表达模式是否可以成为先前建立的免疫亚型之间差异的基础，本研究确定了每个样本的各种 HCC 亚型，并研究了它们与代谢表型的重叠程度。静止和胆固醇生成亚型可归为Cluster 2，而糖酵解和混合亚型主要归为Cluster 1或淋巴细胞耗竭亚型（图 4D），表明 TTK 亚型与 HCC 中的代谢微环境之间存在关系。

05

与HCC的两种TTK亚型相关的基因组特征和信号通路

接下来本研究使用来自 TCGA-LIHC 数据集的基因组数据分析了两个簇中体细胞突变的分布（图 5A、B）。CTNNB1的突变在簇 1 中占优势，而 TP53的突变在簇 2 中占优势。对比两簇突变基因(图5C)，发现TP53和RB1在两簇突变频率上差异最大。由于体细胞突变是多种突变过程的结果，为了全面表征基因组特征，本研究确定了两种 HCC 亚型的五个突变特征。C > A_DNA_Repair 和 DNA_MMR_Deficiency 在簇1 中占主导地位（图5D），而吸烟和 DNA_MMR_Deficiency 是簇 2 中的主要模式（图 5E）。

图 5

本研究为ssGSEA选择了几个基质TME的标志物，发现簇1的DNA损伤反应得分显著高于簇2，而簇2的血管生成和上皮间质转化得分显著高于簇1(图5F)。基于两簇间表达模式和突变频率的差异，本研究从MsigDB和KEGG数据库中为ssGSEA筛选出致癌通路相关基因，发现在组间仅受体酪氨酸激酶(RTK)-RAS通路存在显著差异(图5G)。因此，RTK-RAS是介导TTK模式的主要通路。

06

建立TCscore预测HCC患者的TTK 类型

本研究开发了一个评分系统，称为 TCscore，根据来自 TCGA-LIHC 的上述 18 个 GSTTK 的表达水平来量化 TTK 模式。TCscore、基质通路评分和致癌通路评分的 Spearman 相关性分析揭示了 TCscore 与肿瘤间或肿瘤微环境信号通路之间的关系。使用应用于 TCGA-LIHC 队列的公式计算 ICGC-LIRI-JP 队列患者的 TCscore，以验证 GSTTKs 特征的预后能力。通过时间依赖性 ROC 分析评估 TCscore 的敏感性和特异性。TCGA-LIHC 队列（训练集）和 ICGC-LIRI-JP 队列（测试集）中的 AUC 值分别为 0.724和0.729（图 6A、B）。

图 6

进一步本研究选择0.738的最佳阈值进行分类，分类后进行Kaplan-Meier和cox回归分析。根据 TCGA-LIHC（图 6C）和 ICGC-LIRI-JP（图 6E）病例的 TCscore 最佳截止值绘制 OS 的 Kaplan-Meier 曲线，TCscore 高的患者比 TCscore 低的患者的生存时间相对较短。单因素和多因素 cox 回归分析表明，TCscore 是 TCGA-LIHC（图 6D） 和 ICGC-LIRI-JP（图 6F）中 HCC 患者的独立预后因素。为了评估TCscore在免疫治疗中的预测价值，本研究使用TIDE算法评估与治疗反应的相关性，发现针对TCscore的TIDE评分差异与TTK模式相似(图6G)。Spearman相关分析显示，TCscore与CAF细胞呈负相关，与MDSC呈正相关(图6H)。

本研究还利用GDSC数据库的药物信息计算HCC常用化疗药物的半最大抑制浓度(IC50)值，结果发现，高TCscore组索拉非尼的IC50值高于低TCscore组(图6I)，而其他四种药物(阿霉素、长春碱、丝丝霉素和顺铂)的IC50值则相反(图6J-M)，这为临床免疫治疗与化疗结合时化疗药物的选择提供了依据。

小编总结

本研究通过高通量筛选试验鉴定了调节肿瘤细胞对GSTTKs敏感的基因，这些基因在 HCC 中表现出差异表达以及与预后的相关性。应用无监督聚类根据 GSTTK 将 HCC 患者分类为亚型。比较亚组间的肿瘤微环境、代谢特性和遗传变异。还开发了一种基于预后 GSTTKs 的评分算法，称为 TCscore，并评估了其对免疫治疗反应的临床和预测价值。本研究的缺陷在于TTK 模式和 TCscore 基于生物信息学分析，需要在大样本量的临床试验中进行验证。TTK 模式中的关键 GSTTK 和相关通路，例如 NR4A3、RECQL4 和 RTK-RAS 信号，需要在未来进行实验验证。总之，本研究为免疫相关生信研究提供了新思路，希望大家在阅读之后有所收获！