同时阻断 ERK 和自噬过程的药物抑制剂组合有望治疗 PDAC | MedChemExpress

胰腺导管腺癌(PDAC)的特征是 KRAS- 和自噬依赖的致瘤生长，但 KRAS 在自噬中的作用尚未确定。研究人员使用之前已验证过的 siRNA 寡核苷酸链 23 进行急性 KRAS 的抑制，发现其可在 7 个 KRAS 突变的人类 PDAC 细胞系中的 6 个增加2~10 倍的自噬通量。与此同时，还发现使用 RAS 抑制剂 ARS-1620 治疗 KRAS g12c 突变的 MIA PaCa-2 细胞，可导致自噬通量的类似增加。随后，研究人员通过免疫印迹等实验，证明 KRAS 的抑制会增加 KRAS 突变型 PDAC 细胞系中的自噬通量，表现为自噬体形成、溶酶体融合和自噬体相关 LC3B-II 的增加（如 Figure 1.所示）。

Figure 1.KRAS 抑制增加 KRAS 突变 PDAC 细胞系的自噬通量

研究人员发现，在做检测的 8 个人源 PDAC 细胞中，所有细胞均能稳定的表达 mCherry-EGFP-LC3B 自噬载体，并在 ERK 抑制剂（SCH772984）使用的短期（24 小时）内，可刺激细胞在自噬方面出现 3-30 倍的增长。为了证实自噬通量的增加，研究人员观察到在 ERK 抑制剂（SCH772984）处理细胞中 LC3B-II 和 LC3B-I 的比例相较于对照组，无论是在基础情况下，还是在 bafilomycin A1 存在的情况下，都可以抑制通量。将这些结果扩展到 iKRAS 模型，我们观察到 ERK 的抑制也抑制了实验检测的三种小鼠 iKRAS PDAC 系中三种的 Kras G12D 沉默，导致自噬通量广泛增加 10- 30 倍（如 Figure 2.所示）。

Figure 2. ERK 的抑制提高自噬通量

值得注意的是，我们进一步证实了 ERK 的抑制能够刺激 AMPK 的激活，且观察到 mTORC1 信号下降。RPPA 数据的相关分析证实，磷酸化 AMPK 水平与 ERK 抑制的标志物呈负相关，而 mTOR 通路成分的减少与 ERK 抑制的标志物呈正相关。随后，研究人员利用液相色谱、 q-RTPCR 等实验方式，证明 ERK 的抑制会增强自噬，并提高自噬信号、核苷酸代谢和基因转录大水平（如 Figure 3.所示）。

Figure 3. ERK 的抑制对 mTOR 的影响

研究人员发现 ERKi 处理细胞后，胞内线粒体的质量降低，线粒体病理通量增加。ERK 的抑制使人PDAC系（KRAS短期抑制）和 iKRAS 小鼠 PDAC 系（KRASG12D 抑制）的线粒体融合增强。总的来说，ERK 抑制和 KRAS 抑制都显著影响线粒体网络的重排，与通常观察到的碎片化性质相比，更倾向于线粒体的融合。之前有研究表明，线粒体融合与线粒体活性增加有关。然而，在研究过程中，研究人员发现在 ERKi 处理 1.5 h（发现线粒体融合的时间点）的细胞内没有观察到细胞耗氧量的任何变化。此外，ERKi 处理人 PDAC 细胞 24 小时后，细胞的基础耗氧量和 ATP 的产生或降低或不变（如 Figure 4.所示）。

Figure 4. ERK 抑制和 KRAS 沉默损害 PDAC 细胞线粒体功能

鉴于目前临床上还没有特异性的自噬抑制剂，但羟氯喹作为溶酶体酸化的一种间接自噬抑制剂，经常被使用。因此，我们发现与SCH772984同时治疗，ERK (ulixertinib/BVD-523)38 在化学上和机制上明显或 MEK 抑制剂 binimetinib 协同地增强氯喹介导的生长抑制。利用 Chou-Talalay 或 BLISS 的方法，可在大范围的ERKi 或 MEKi 浓度下观察到协同作用。值得注意的是，无论采用 MTT 还是活细胞计数的方式，都能观察到协同作用。与此同时， ERKi 的单独给药有限度的造成细胞凋亡，但联合治疗后细胞明显增加（如 Figure 5. 所示）。

Figure 5.ERK 信号和自噬的双重抑制协同损害 PDAC 增殖

为了将这些体外发现扩展到体内肿瘤生长，研究人员对 ERKi 和羟基氯喹在两种异种 kras 突变的胰腺肿瘤源性异种移植(PDX)模型中的联合应用。在这两种模型中，ERKi 的单独使用对肿瘤生长有显著影响，而两者的结合更加有效地阻止了肿瘤的进展并延长了生存期。此外，ERKi 和羟基氯喹联合治疗的小鼠肿瘤明显小于单独使用 ERKi 治疗的小鼠肿瘤。因此得出结论， 协同抑制 ERK1/ERK2和自噬与单独抑制 ERK 对 PDAC 的抑制作用会更加明显（如 Figure 6. 所示）。

Figure 6.使用 ERKi 和羟基氯喹联合治疗小鼠的影响

小M 的小思考：

北卡大学的研究人员发现，KRAS 的抑制增加了自噬通量，而其效应物 ERK 的药理抑制也增加了自噬通量。此外，还证明 KRAS 的抑制或 ERK 抑制都会导致糖酵解和线粒体功能降低。随后推测，ERK 抑制可能因此增强 PDAC 对自噬的依赖，部分通过破坏其他 KRAS 或 ERK 驱动的代谢过程。进而得出结论，同时阻断 ERK 和自噬过程的药物抑制剂组合有望成为治疗 PDAC 的高效方式。