【辰辉创聚生物】昆虫蛋白表达|昆虫杆状病毒表达系统|真核蛋白表达|Bac-to-Bac 系统

昆虫杆状病毒表达系统（Insect Baculovirus Expression Vector System, IBEVS），是利用杆状病毒（如 Autographa californica 多角体病毒，AcMNPV）感染昆虫细胞（如 Sf9、Sf21、High-Five 细胞）实现外源蛋白表达的真核表达工具。

Bac-to-Bac 系统是该体系中的一种常用工具，通过将目的基因整合入含有整套 AcMNPV 基因组的 Bacmid，在大肠杆菌中构建重组病毒，然后转染昆虫细胞获得重组病毒粒子，最后进行昆虫蛋白表达。

昆虫杆状病毒表达系统优势与特点

真核翻译后修饰能力：昆虫细胞具备真核系统中的糖基化、折叠、寡聚化等能力，所表达的蛋白在结构与功能上更接近自然状态。

高表达水平：通过强启动子（如 pPolh 或 late viral promoter）驱动，表达量可达 1–500 mg/L，远高于哺乳动物细胞系统。

灵活安全：杆状病毒不具备感染脊椎动物的能力，安全性高；其较大的基因组能容纳较大或多基因片段。

昆虫杆状病毒表达系统类型

杆状病毒-昆虫细胞表达系统（BEVS）

是最广泛使用的系统，利用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行高效表达。常用细胞系包括 Sf9、Sf21（来源于Spodoptera frugiperda） 及 High Five（BTI-Tn-5B1-4，来源于Trichoplusia ni），其中 High Five 表现量明显高于 Sf9。BEVS 能够快速表达、大殖规模进入后期翻译阶段等优点是其主要优势。

杆状病毒自由系统（Plasmid-based/InsectDirect）

近年来出现用于昆虫细胞的病毒自由表达系统，如 InsectDirect系统，将重组载体直接转染昆虫细胞，省略了重组病毒构建过程，时间显著缩短（通常几天内即可表达蛋白），适合高通量筛选。

昆虫蛋白表达服务流程

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1、项目评估

客户提供目标基因序列、表达需求（是否分泌表达、是否需要标签 His/Fc/Flag 等、是否有翻译后修饰要求）后，进行评估蛋白的性质（分子量、结构域、信号肽预测、跨膜区域、潜在糖基化位点等），并提出可行性建议。

2. 实验方案设计

确定使用杆状病毒系统适合大规模表达和复杂蛋白）还是病毒自由系统（适合快速小规模表达）。设计标签策略、分泌信号肽选择、载体构建方案。

3、基因优化

对目标基因进行密码子优化，以适应Sf9/Sf21/High Five等昆虫细胞的表达偏好。保留或删除信号肽，根据是否需要分泌表达决定。

4、载体构建

将基因克隆入杆状病毒转移载体或非病毒载体（如 InsectDirect）。常见启动子：p10、polh、hr5-IE1 等。加入亲和标签（His、Strep、Fc 等），便于后续纯化。

5、重组病毒或表达载体制备

杆状病毒系统（BEVS）

1）将转移载体与 bacmid 结合，转入大肠杆菌筛选重组病毒 DNA。

2）转染昆虫细胞（如 Sf9），获得 P1 病毒。

3）放大病毒至 P2/P3，用于大规模感染。

病毒自由系统

直接将重组质粒转染昆虫细胞，无需制备病毒，几天内即可检测蛋白。

6、蛋白表达

1）小规模表达测试

在 Sf9/Sf21 或 High Five 细胞中感染/转染，检测表达水平。

通过 SDS-PAGE / Western blot 确认条带位置和表达量。

2）大规模生产

根据结果选择产量较高的细胞株/条件，进行升规模培养（如 0.5 L – 10 L 或更多）。

收集细胞裂解液或培养上清（若为分泌蛋白）。

7、蛋白纯化与质控

1）纯化流程

常见方法：Ni-NTA 亲和纯化（His 标签）、Protein A/G（Fc 标签）、离子交换、凝胶过滤等。可根据客户要求提供不同纯度（研究级、试剂级、甚至 GMP 级）。

2）质量检测

a. 纯度检测：SDS-PAGE、HPLC。

b. 分子量和正确性：质谱（MS）。

c. 活性检测：客户提供实验方案或由服务方进行功能测定。

d. 内毒素、宿主蛋白、残留 DNA 等指标（适用于临床或诊断用蛋白）。

昆虫蛋白表达在真核蛋白表达中的应用

昆虫表达系统是重要的“真核蛋白表达”平台之一，与酵母、哺乳动物系统相比具有独特优势。其在表达结构复杂、修饰依赖性强的真核蛋白（如病毒包膜蛋白、受体蛋白、分泌蛋白）方面应用广泛。

例如，通过昆虫杆状病毒表达系统表达的丙型肝炎病毒 E1/E2 跨膜结构域蛋白，在昆虫细胞中可实现正确的折叠和糖基化。

此外，用于表达大型蛋白的案例也较多。在 Hi5（High-Five）细胞中，通过选择适宜细胞株和优化培养条件，表达量可高达 10 mg/L，纯度达 95%。

随着生命科学和生物制药的发展，对复杂蛋白（尤其是真核蛋白和跨膜蛋白）的高效表达需求不断增加。昆虫细胞因其能够实现复杂翻译后修饰（如糖基化）和较高表达量而成为重要的真核蛋白表达系统。其中，昆虫杆状病毒表达系统被广泛运用于昆虫蛋白表达，在科研和产业上发挥重要作用。