Nature系列|免疫浸润分析使用ssGSEA、GSVA都可以吗

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结论先行

• 两者都适合做免疫浸润分析（bulk RNA-seq、单细胞伪合并/pseudobulk、空间转录组数据都可），前提是用高质量的免疫细胞特异基因集（如 LM22、xCell/MCP-counter 的细胞签名、自己从 scRNA 提炼出来的细胞签名），并处理好批次与归一化。
• ssGSEA：逐样本、基于秩的“单样本 GSEA”。对极值/尺度更稳，样本内排名为主，适合样本很少、或你只关心每个样本内部免疫谱的相对强弱。
• GSVA（默认核密度法）：在样本集合上对基因表达分布做非参数变换，再对基因集做“随机游走”累积差分，更擅长在多样本之间对比、对中低表达的稳定性更好，但需要一批样本一起跑才能体现优势。

原理与差异

为什么它们能用于“免疫浸润”？ “免疫浸润”本质是细胞组成与活性在转录层面的影子。若有“某免疫细胞特异高表达的一组基因”（签名），那这组基因在一个样本里整体越靠前/越高，通常说明：

1. 该细胞占比更高（组成效应），或
2. 该细胞更活跃（状态效应），或二者兼有。 ssGSEA/GSVA 正是把“这一组基因是否整体靠前/更活跃”转成一个分数，因此可以作为免疫浸润的相对指标。

关键提醒：它们给的是相对活性/丰度分而非绝对“比例”。要想获得“细胞比例”，优先用去卷积方法（如 CIBERSORTx、EPIC、MCP-counter、quanTIseq），或用流式/病理定量来验证。

什么时候选谁？

• 选 ssGSEA：
  • 极少样本（甚至单个样本、单个病人报告）
  • 异构平台或批次差很大、只能做样本内排名来规避尺度问题
  • 想把签名直接应用到单细胞的 pseudobulk或空间 spot且样本量偏小
• 选 GSVA（默认 method="gsva"）：
  • 队列型研究，需比较组间差异、做下游统计建模
  • 你关心中等表达的稳定趋势，希望分数对跨样本比较更平滑
• 折中：用 GSVA::gsva() 同一接口里跑 method="ssgsea" 或 "gsva"，两者都算一遍，选择更稳定/更符合生物学的。

实战要点（避免“伪浸润”）

1. 归一化/批次
   • bulk：建议 TPM/CPM + log1p，或 DESeq2 VST；跨批次用 ComBat/limma removeBatchEffect。
   • scRNA-seq 的 pseudobulk：先每样本/每亚群求和再 TMM/VST。
2. 细胞签名质量（也就是免疫基因集的质量）
   • 物种匹配、去掉非特异或普遍上调（如核糖体、热休克、IFN 即时早基因）
   • 签名大小 20–200 基因较稳，过小/过大都不理想；减少不同细胞签名间的重叠
3. 可比性与统计
   • ssGSEA 结果常对每个基因集跨样本 z-score后再做组间比较；GSVA 直接进入线性模型/差异分析。
   • 多基因集比较要做多重校正（BH/FDR）。
4. 正交验证
   • 与去卷积（CIBERSORTx/MCP-counter/xCell）做相关性
   • 与 IHC/IF 计数、流式、病理评估对照
5. 单细胞/空间
   • 单细胞层面更推荐模块打分（Seurat AddModuleScore、AUCell），或先 pseudobulk 再 GSVA/ssGSEA，减少稀疏度影响。
   • 空间转录组：对 spot 做 ssGSEA/GSVA 后，用组织学区域或细胞解卷积结果交叉验证。

文献中使用ssgsea做免疫浸润的案例

• (A) Correlation between MCTS1 expression and relative abundance of 24 types of immune cell. The size of dot corresponds to the absolute Spearman’s correlation coefficient values.

mehods Immune Infiltration Analysis A total of 24 immune cells were used to calculate the level of immune infiltration, and the relative enrichment score of these immune cells in breast cancer was assessed by single-sample GSEA, which was accomplished using the R package GSVA (Bindea et al, 2013). The correlation between the expression of MCTS1 and these immune cells was investigated using the Spearman’s correlation analysis, and the differences in the level of immune infiltration between the high and low MCTS1 expression groups were evaluated using the Wilcoxon ranksum test. 结果描述 Correlation Between MCTS1 Expression and Immune Infiltration The expression of MCTS1 was significantly negatively correlated with the levels of immune cell infiltration of natural killer (NK) cells (r = –0.240, p < 0.001), CD8+ T cells (r = –0.220, p < 0.001), effector memory T (TEM) cells (r = –0.210, p < 0.001), and plasmacytoid dendritic cells (pDCs) (r = –0.210, p < 0.001) (Figure 7A).

https://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/GSVA/inst/doc/GSVA.html#:~:text=Gene%20set%20variation%20analysis%20,wise