三代测序100问（21）：三代测序在遗传病检测上的核心优势

在精准医学的时代，基因测序已成为遗传病诊断的“金标准”。然而，在临床实践中，许多医生和研究者常面临这样的困惑：明明临床表型高度疑似某种遗传病，但常规的二代测序（NGS）报告却显示“阴性”或“意义未明”。这往往是因为二代测序受限于读长，存在某些难以逾越的检测“盲区”。

最近，李老师也频频收到此类咨询：“在遗传病检测方向，三代测序究竟有哪些不可替代的优势？” 今天，我们就来深入探讨长读长测序（TGS）如何在关键的临床场景中，补齐短读长测序的短板，为疑难遗传病诊断提供确凿的证据。

单倍型分型：从“算法推测”走向“直接观测”

对于常染色体隐性遗传病（如耳聋、白化病等），确诊的关键在于确定两个致病突变是位于同一条染色体上（顺式，Cis）还是分别位于两条同源染色体上（反式，Trans）。前者通常不致病（携带者），后者才致病（复合杂合子）。

• 二代测序的局限： 由于读长短（通常约150bp），无法同时覆盖相距较远的两个突变位点。临床上往往需要检测父母样本（家系分析）或依赖统计学算法进行推断，这在缺乏父母样本或突变极其罕见时面临巨大挑战。
• 三代测序的优势： 得益于其超长读长（可达10kb-100kb+），一条测序序列（Read）往往能轻松跨越数个甚至数十个基因。这意味着我们可以在一条Read上直接观察到两个突变位点是否共存。三代测序无需家系验证，即可直接完成单倍型分型（Phasing），一锤定音地判断突变来源，极大地提高了诊断效率。

结构变异检测：跨越断点，还原全貌

基因组并非只有简单的单碱基突变（SNV），还存在大量的结构变异（Structural Variants, SV），如大片段的缺失、重复、倒位和插入。

• 二代测序的局限： 面对跨度超过其读长的缺失或插入，二代测序往往只能通过覆盖度变化或断裂点处的异常比对来间接推断，这导致其在SV检测上假阴性率较高，且难以精确界定断点位置。
• 三代测序的优势： 三代测序凭借长读长，能够一次性完整跨越整个变异区域。以 -地中海贫血为例，其致病机制常涉及 HBB 基因簇的大片段缺失。三代测序不仅能精准检出这些缺失，还能精确通过断点序列还原复杂的结构重排。对于疑难地贫、染色体微缺失/微重复综合征等疾病，三代测序提供了更敏锐的“显微镜”。

真假基因区分：拨开高度同源的迷雾

人类基因组中存在许多与功能基因序列高度相似的假基因（Pseudogenes），它们是二代测序的“噩梦”。

• 二代测序的局限： 由于序列高度同源，短读长序列极易发生错误比对（Mis-mapping）。例如在先天性肾上腺皮质增生症（CAH） 中，功能基因 CYP21A2 与假基因 CYP21A1P 高度相似。二代测序常将假基因上的序列错误地比对到真基因上（误报突变），或反之（漏检突变）。
• 三代测序的优势： 三代长读长序列通常包含了基因两侧特异性的侧翼序列或内含子差异序列。这些独特的“锚点”使得三代测序能够轻松区分真假基因，将Reads精准地回帖到正确的位置。对于 CYP 家族、SMN1/2（脊髓性肌萎缩症）、HLA 等复杂基因家族，三代测序具有绝对的分析优势。

动态突变检测：攻克重复序列扩增难题

许多严重的神经发育和神经退行性疾病，如脆性X综合征（FMR1）、亨廷顿舞蹈症（HTT），均由基因内的短串联重复序列（STR）异常扩增引起，这类突变被称为动态突变。

• 二代测序的局限： 当重复序列的长度超过读长，或者GC含量极高时，二代测序往往会“卡”在重复区域中，无法测通，更无法准确计算重复次数。
• 三代测序的优势： 三代测序能够完整地通读整个重复扩增区域，无论其长度是几十还是几百个重复单位。它不仅能定性地判断是否存在扩增，还能定量地计算重复次数，甚至检测重复序列内部的甲基化状态（如 FMR1 的全甲基化），这对疾病的严重程度预测和预后评估至关重要。

互补而非替代，共筑精准诊断

总结而言，三代测序在区分单倍型、解析复杂结构变异、分辨真假基因、检测动态突变等四大关键方向上，具备二代测序无法比拟的决定性优势。

然而，李老师最后强调，现阶段三代测序在遗传病检测中的核心价值，并不是要完全替代二代测序（后者在SNV检测成本和通量上仍有优势），而是在关键场景中补齐“短读长做不到”的盲区。二者相辅相成，通过“二代筛查+三代确诊”或“双剑合璧”的策略，共同构建更全面、更精确的遗传病检测体系，让每一个罕见病患者都能找到确切的病因。

好了，这一期就到这里，我们下期见。