## ■ 1. 背景介绍

HaloPROTAC3 (T32043)，CAS: 1799506-07-2 是一种用于诱导HaloTag融合蛋白选择性降解的双功能小分子，通过劫持von Hippel–Lindau（VHL）E3泛素连接酶发挥作用。其结构由高亲和力VHL配体与一种针对HaloTag的配体通过一条含16个原子的连接臂相连，属于“E3连接酶配体–连接子缀合物”，从而在VHL与携带HaloTag的目标蛋白之间建立有效的“诱导邻近”。HaloTag源自工程化的卤代烷脱卤酶，能与氯烷配体形成共价键；HaloPROTAC3整合此类配体基团以结合HaloTag，同时招募VHL。

在机制上，HaloPROTAC3促使HaloTag融合蛋白与CRL2VHL复合物（VHL–Elongin B/C–CUL2–RBX1）形成有利于泛素转移的三元复合物，借助E2酶将泛素接力转移到目标蛋白赖氨酸位点，组装K48型多泛素链，并被26S蛋白酶体识别与降解，整体运行于泛素-蛋白酶体系统（UPS）中。16原子连接臂决定两端蛋白的空间取向与动态，影响三元复合物的协同稳定性与催化周转，从而提升降解效率，体现事件驱动药理学特征[1,2]。借此，HaloPROTAC3将VHL的底物特异性从内源底物重定向到带HaloTag的目标蛋白上。

在功能与研究用途上，HaloPROTAC3可在细胞中快速、可逆地清除HaloTag融合蛋白，辅助以时间分辨方式解析蛋白功能。相较仅抑制活性位点的策略，直接降解可同步消解酶学与支架/复合体依赖等非酶学功能，按降解与再合成动力学揭示靶点依赖性。作为VHL依赖的E3配体与连接子缀合物，HaloPROTAC3还是研究“E3配体选择—连接臂长度—三元复合物协同”关系的模块化化学探针，有助于量化连接臂长度与几何构型对降解功效的影响[2]。在通路层面，HaloPROTAC3通过定向CRL2VHL的催化活性至HaloTag融合蛋白，提升该蛋白的泛素化通量并降低其稳态丰度；依托内源性E1/E2与蛋白酶体完成信号转导，便于与蛋白酶体或NEDD8化调控剂联用以剖析CRL活性门控与降解因果链路[1,2]。作为HaloTag融合蛋白降解工具，HaloPROTAC3为在活细胞中系统探索靶向蛋白降解的关键参数提供了通用、可移植的化学手段。

## ■ 2. 文献分享

### ■ 2.1 Proof of concept: targeted protein degradation of the stress granules component G3BP1 as an antiviral strategy against norovirus infection.

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▲ 通过化学结构式展示HaloPROTAC3的分子组成、CellTiter-Blue检测不同浓度处理后代谢性细胞死亡并计算CC₅₀、及流式细胞术检测Halotag⁺细胞比例（含设门策略、代表性直方图及剂量-响应曲线拟合参数），综合证实HaloPROTAC3可高效结合Halotag及HaloG3BP1融合蛋白，并浓度依赖性诱导细胞死亡。

HaloPROTAC3 (T32043) 被报道可诱导Halotag与HaloG3BP1融合蛋白的浓度依赖性降解，西方印迹及定量结果予以佐证。在BV2 ΔG3BP1 + HaloG3BP1细胞中，HaloPROTAC3使目标蛋白水平呈时间依赖性下降：处理24小时约为对照的45%，48小时约为对照的6%。研究同时指出，HaloG3BP1蛋白下降取决于HaloPROTAC3与VHL泛素连接酶的相互作用。与此一致，加入VHL抑制剂VH032可引发统计学显著且剂量依赖的HaloG3BP1水平恢复，尤其在48小时时更为明显。在使HaloG3BP1被降解的条件下，HaloPROTAC3显示出针对小鼠诺如病毒（MNV1）的抗病毒活性。进一步地，在接受HaloPROTAC3处理的细胞中联合VH032可部分恢复感染诱导的细胞死亡以及细胞上清中的感染性病毒产量。这些发现共同表明，HaloPROTAC3作为依赖VHL的靶向降解剂，能够高效且逐步清除HaloG3BP1融合蛋白，并在MNV1体系中展现抗病毒作用；当通过药理学方式阻断其与VHL的结合时，不仅靶标降解而且相关的抗病毒指标均出现相应的回升。[3]

### ■ 2.2 HaloPROTAC3 does not trigger the degradation of the halotagged parasitophorous vacuole membrane protein UIS4 during Plasmodium liver stage development.

![003.png](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12303165/62fbcfc2f798434a40072e0cd7e5688a.png)

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▲ 通过化学结构式展示HaloPROTAC3及其VHL对照配体、mCherry-GFP-HT和HT-GFP-FIS1两种融合蛋白表达构建体的示意图及Airyscan显微成像验证其表达定位，结合HaloPROTAC3处理后的共聚焦显微成像及剂量-响应曲线分析，证实HaloPROTAC3可高效诱导Huh7细胞中可溶性胞质及跨膜HT融合蛋白的降解。

HaloPROTAC3 (T32043) 被描述为可募集VHL的化合物，能够在细胞模型中诱导靶蛋白降解。在Huh7细胞中，HaloPROTAC3 可触发可溶性胞质型与跨膜型HaloTag融合蛋白的降解，显示其可作用于不同细胞定位的蛋白。剂量-反应数据进一步表明，HaloPROTAC3 可使可溶性mCherry-GFP-HT构建体与跨膜HT-GFP-FIS1构建体的荧光信号随浓度升高而降低，指示这些带有HaloTag的报告蛋白被浓度依赖性地清除。这些结果共同支持HaloPROTAC3在人体肝癌细胞中通过募集VHL E3连接酶机制，促使含HaloTag的胞质与膜相关靶标发生降解。除在宿主细胞工程系统中的活性外，HaloPROTAC3 还被报道可与疟原虫P. berghei肝期的UIS4-HT结合，表明该化合物能在受感染肝细胞内与寄生虫包裹体膜上的HaloTag可及位点发生相互作用。综合来看，研究呈现了两点关键信息：HaloPROTAC3 在Huh7细胞中作为VHL募集型降解剂作用于HaloTag融合蛋白，并且在P. berghei肝期寄生虫中表现出对UIS4-HT的可检测结合。[4]

### ■ 2.3 HaloPROTAC3 treatment activates the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum in nonengineered mammalian cell lines.

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▲ 通过RT-qPCR检测HaloPROTAC3处理及衣霉素诱导内质网应激后HCT116细胞中内质网应激标志物mRNA表达水平，并与siRNA介导的IGF2BP3敲低组进行对比，证实HaloPROTAC3介导的IGF2BP3降解不会激活内质网应激反应。

HaloPROTAC3 (T32043) 可与E3连接酶VHL结合，IC50为0.54 ± 0.06 µM，并被用于在HCT116细胞中以PROTAC策略降解IGF2BP3。在表达HaloTag-IGF2BP3的HCT116细胞中，HaloPROTAC3约4小时即可实现约75%的蛋白降低。在未工程化的HCT116细胞中，HaloPROTAC3处理7小时激活UPR靶基因并降低IRE1的RIDD靶标水平，且UPR诱导程度与Halo-IGF2BP3表达细胞相当。蛋白层面上，HaloPROTAC3导致XBP1s蛋白累积，提示IRE1分支被激活，且结果显示IRE1分支对HaloPROTAC3更为敏感。在HCT116细胞中，HaloPROTAC3诱导轻度内质网应激并激活UPR。在多种细胞类型中，HaloPROTAC3在HCT116、HeLa与HEK293T细胞中均诱导UPR，其特征为XBP1s与HSPA5 mRNA的增加，整体上体现为在未工程化哺乳动物细胞系中激活UPR。转录组数据显示，HaloPROTAC3处理期间最显著上调的基因归属于UPR的IRE1分支；在HCT116细胞中，除IRE1的转录靶标外，RIDD靶标也被显著下调，其幅度与强ER应激药物处理所致的下调相当。[5]

### ■ 2.4 Comparative analysis and directed protein evolution yield an improved degron technology with minimal basal degradation, rapid inducible depletion, and faster recovery of target proteins.

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![008.jpeg](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12303165/f11dc47d895d7c38584113d4477dacee.jpg)

▲ 通过比较四种配体诱导蛋白降解技术（含miniAID、miniIAA7、FKBP12(F36V)及HaloTag degron系统）在KOLF2.2J iPSC中敲入内源CTCF和RAD21后，经各自配体处理不同时间（0、1、6、24小时）后Western blot检测靶蛋白降解效率、配体洗脱后24及48小时蛋白恢复率，并结合单细胞分析内源VHL/CRBN及CAG启动子驱动的OsTIR1表达，综合证实HaloPROTAC3可实现高效、快速的靶蛋白降解，且降解后蛋白恢复动力学与其他系统相当。

HaloPROTAC3 (T32043) 在本研究的建议条件下进行评估。作者在1 μM浓度下观察到，HaloPROTAC3可显著降低诱导多能干细胞（iPSC）的增殖，显示在该实验剂量下对细胞生长具有明显影响。研究同时考察了与HaloPROTAC3相关的E3连接酶表达情况。结果指出，VHL（HaloPROTAC3）E3连接酶在不同细胞簇之间的表达存在显著差异，并且在规模最大的细胞簇中几乎不存在。上述结果将1 μM条件下HaloPROTAC3对iPSC增殖的明显抑制，与其相关VHL（HaloPROTAC3）E3连接酶在细胞簇间表达高度异质这一背景联系起来，其中在最大细胞簇中的表达接近缺失。整体来看，研究表明HaloPROTAC3在所测试的剂量下对iPSC增殖具有显著影响，同时其所依赖的VHL（HaloPROTAC3）E3连接酶在细胞群体层面的表达呈现强烈的簇间差异，并在最大的细胞簇中接近缺乏。[6]

### ■ 2.5 Inducing Receptor Degradation as a Novel Approach to Target CC Chemokine Receptor 2 (CCR2).

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![010.jpeg](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12303165/ba76b65ca6197718568ae179ccd635e3.jpg)

▲ 通过HiBiT裂解检测法，在HEK293T细胞中表达CCR2-HaloTag-HiBiT融合蛋白后，经不同浓度HaloPROTAC3处理24小时，并通过加入LgBiT蛋白检测发光信号，证实HaloPROTAC3可浓度依赖性降解CCR2蛋白。

HaloPROTAC3 (T32043) 由带氯烷基的VHL配体（VL285）改造而成。在裂解型HiBiT实验中，1 µM的HaloPROTAC3使CCR2水平均值下降约35%。浓度梯度测试显示，HaloPROTAC3对CCR2呈浓度依赖性的降低，表观DC50为42 nM，24小时时的表观Dmax为38 ± 5%。实时动力学结果表明，1 µM的HaloPROTAC3诱导的CCR2-HaloTag-HiBiT下降速度快于环己酰亚胺单独作用，并且在是否合用环己酰亚胺的条件下均达到更高的最大降解幅度。作用机制研究支持其招募VHL：在HaloPROTAC3存在下，VHL配体VL285的预处理将CCR2的最大降解幅度降至16%，而未预处理时为32%。抑制剂联用实验进一步说明通路依赖性：与蛋白酶体及NEDD8化抑制剂共同处理可在HaloPROTAC3作用期间使CCR2水平完全恢复，提示其通过蛋白酶体发挥降解作用。综合结果表明，HaloPROTAC3通过蛋白酶体诱导CCR2-HaloTag-HiBiT的降解，并能超越受体的天然周转速率，从而主导以蛋白酶体为核心的受体清除。[7]

## ■ 3. 结语

HaloPROTAC3通过招募VHL E3泛素连接酶至HaloTag融合蛋白，形成促进泛素化并经由泛素-蛋白酶体系统实现蛋白降解的三元复合物。文献显示，HaloPROTAC3能高效诱导多种HaloTag融合蛋白在不同细胞环境中的降解，涵盖通过降解G3BP1发挥抗病毒作用、激活内质网应激反应及靶向受体CCR2清除等功能。其活性依赖于VHL的结合及蛋白酶体通路，降解效率受连接臂长度和三元复合物稳定性影响。未来研究可聚焦优化HaloPROTAC3衍生物以提升特异性与效能，拓展其在蛋白功能动态研究中的应用，及在病毒感染和肿瘤等疾病模型中的靶向降解潜力。

## ■ 4. Q&A

Q1: HaloPROTAC3是如何诱导HaloTag融合蛋白降解的？

A1: HaloPROTAC3通过招募VHL E3泛素连接酶与HaloTag融合蛋白形成三元复合物，促进泛素化修饰，进而通过泛素-蛋白酶体系统实现蛋白质的降解。

Q2: 有哪些证据支持HaloPROTAC3的抗病毒活性？

A2: 在BV2 ΔG3BP1 + HaloG3BP1细胞中，HaloPROTAC3使HaloG3BP1蛋白水平随时间和浓度依赖性下降，48小时降至对照的6%，同时展现对小鼠诺如病毒（MNV1）的抗病毒活性。联合使用VHL抑制剂可部分恢复蛋白水平及抗病毒效应，证明其依赖VHL介导作用。

Q3: HaloPROTAC3在不同细胞环境中是否对所有HaloTag融合蛋白均有降解效果？

A3: 不完全是。在Huh7细胞中，HaloPROTAC3能降解胞质及膜相关的HaloTag融合蛋白，并与疟原虫肝期UIS4-HT结合，但在疟原虫肝期发育过程中未诱导UIS4-HT降解，说明其作用具有环境依赖性。

## ■ 5. 参考文献

[1] Bondeson DP, Mares A, et al. Catalytic in vivo protein knockdown by small-molecule PROTACs. Nat Chem Biol. 2015;11(8):611-617.

[2] Gadd MS, Testa A, et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition by the VHL E3 ligase and a bromodomain. Nat Chem Biol. 2017;13(5):514-521.

[3] Echavarria-Consuegra L, Goodfellow I. Proof of concept: targeted protein degradation of the stress granules component G3BP1 as an antiviral strategy against norovirus infection.. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2026;70(3):e0111825.

[4] Lam M, Probst A, Torres L, Lantigua A, Fishbaugher M, Kumar J, et al.. HaloPROTAC3 does not trigger the degradation of the halotagged parasitophorous vacuole membrane protein UIS4 during Plasmodium liver stage development.. Scientific reports. 2025;15(1):18323.

[5] Anisimova A, Karagöz G. HaloPROTAC3 treatment activates the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum in nonengineered mammalian cell lines.. Molecular biology of the cell. 2025;36(5):mr3.

[6] Adli M, Xing D, Bai T, Neyisci O, Paylakhi S, Duval A, et al.. Comparative analysis and directed protein evolution yield an improved degron technology with minimal basal degradation, rapid inducible depletion, and faster recovery of target proteins.. Research square. 2024;():.

[7] Ortiz Zacarías N, Röth S, Broekhuis J, van der Es D, Moreau K, Heitman L. Inducing Receptor Degradation as a Novel Approach to Target CC Chemokine Receptor 2 (CCR2).. International journal of molecular sciences. 2024;25(16):.

■1.背景介绍HaloPROTAC3(T32043)，CAS:1799506-07-2是一种用于诱导HaloTag融合蛋

HaloPROTAC3: 精准诱导HaloTag融合蛋白降解的创新化学工具

■1.背景介绍HaloPROTAC3(T32043)，CAS:1799506-07-2是一种用于诱导HaloTag融合蛋白选择性降解的双功能小分子，通过劫持vonHippel–Lindau（VHL）E3泛素连接酶发挥作用。其结构由高亲和力VHL配体与一种针对HaloTag的配体通过一条含16个原子的连接臂相连，属于“E3连接酶配体–连接子缀合物”，从而在VHL与携带HaloTa

其他

HaloPROTAC3是一种基于VHL E3连接酶的PROTAC降解剂，可高效诱导HaloTag融合蛋白通过泛素-蛋白酶体系统降解。研究显示其在抗病毒、GPCR靶向降解及蛋白功能动态解析中具应用潜力，降解效率受连接臂长度及三元复合物稳定性影响。

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