## ■ 1. 背景介绍

![001.png](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12303165/e61f75cbde2afbb40012245f1e2b2174.png)

▲Z-DEVD-FMK (T6005)，CAS: 210344-95-9

Z-DEVD-FMK (T6005)，CAS: 210344-95-9 是一种细胞可渗透、选择性强且不可逆的半胱天冬酶-3抑制剂，其IC50为18 μM。其作用机制基于四肽样的DEVD识别序列匹配半胱天冬酶-3底物偏好，并依靠分子中的氟甲基酮亲电基团与酶活性位点的催化半胱氨酸发生时间依赖性的共价烷基化，从而将酶固定于失活复合物中并阻断生理底物的水解。由于Z-DEVD-FMK不可逆且具备细胞通透性，能够在活细胞内实现持久的靶点占领，适用于需要长期抑制效应型半胱天冬酶活性的实验设计。

在程序性细胞死亡网络中，外源性通路（死亡受体触发，促发酶为caspase-8）与内源性通路（线粒体释放细胞色素c，依赖Apaf-1激活caspase-9）最终汇聚到效应酶的激活，其中caspase-3是核心执行节点，通过裂解大量含DEVD样基序的底物推进细胞拆解过程[1]。这些底物涵盖DNA修复与染色质调控（如PARP家族；裂解ICAD以释放CAD核酸内切酶）以及细胞骨架与黏附分子，驱动膜起泡与凋亡小体形成等表型[1]。由此，caspase-3将上游信号放大并转化为凋亡的生化与形态学标志。

Z-DEVD-FMK通过在caspase-3被激活后、底物裂解之前进行拦截来调节该通路。其占据DEVD识别槽并对催化半胱氨酸进行共价修饰，从而阻断下游蛋白水解并在细胞体系中削弱由半胱天冬酶激活驱动的凋亡[2]。功能层面，这使得上游事件（如线粒体外膜通透化、细胞色素c释放与促发酶加工）仍可发生，但在执行步骤被化学性沉默时，其表型后果被显著缓冲[1,2]。这一特性便于研究者区分依赖半胱天冬酶与非依赖过程在细胞死亡中的相对贡献。

作为研究工具，Z-DEVD-FMK可用于加药时序实验以界定caspase-3活性成为限速节点的时间窗，用作“拯救”手段验证遗传扰动或应激诱导表型是否依赖caspase-3，并在敏感的细胞培养操作中降低背景性凋亡以稳定观测指标。Z-DEVD-FMK的选择性与不可逆性支持对caspase-3在更广泛半胱天冬酶网络中的特异作用进行清晰解析，而其细胞通透性便于在多种细胞类型中应用，从而用于描绘通路拓扑、确认凋亡实验中的靶点占领，并将上游信号与末端执行事件加以分离[1,2]。

## ■ 2. 文献分享

### ■ 2.1 A small molecule that selectively inhibits the growth of Epstein-Barr virus-latently infected cancer cells

![002.png](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12303165/37306155e333497bc001b0b69adf8e48.png)

![003.png](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12303165/4a3cd7b85c52666aadf31774add03b67.png)

▲靶向化合物 CetB 抗 EBV 阳性 B 细胞淋巴瘤的作用机制示意图。 高通量药物筛选鉴定出活性化合物 CetB。机制研究表明，CetB 一方面通过抑制 EBNA1 蛋白的稳定性来阻断 EBV 病毒复制与存活信号，另一方面通过抑制 PARP1 活性阻断 DNA 损伤修复，并诱导细胞周期阻滞于 G1 期。上述双重抑制作用最终协同诱导肿瘤细胞发生凋亡（Apoptosis）。

Z-DEVD-FMK (T6005) 在本研究中被用于作为半胱天冬酶3/7抑制剂，以检验在CetB处理条件下对EBNA1调控的影响。研究采用的策略为：在LCL细胞中，以不同浓度的CetB进行孵育，并分别在存在或不存在Z-DEVD-FMK的条件下处理，随后进行EBNA1抗体的免疫印迹检测。结果显示，Z-DEVD-FMK能够有效阻断CetB诱导的EBNA1蛋白水平下降。在具体实验条件上，LCL细胞接受了48小时的CetB暴露，并在该过程中使用Z-DEVD-FMK（200 μg/mL）；检测时以EBNA1为免疫印迹指标，并以GAPDH作为内参。依据这一实验流程与读出，数据表明，当与CetB共同作用时，加入Z-DEVD-FMK可在免疫印迹中保持EBNA1蛋白的丰度，相比未加入时出现的EBNA1降低，呈现出明显的阻断效应。整体而言，通过在LCL细胞体系中设定“是否加入Z-DEVD-FMK”的条件对照，并在48小时共孵育后以EBNA1免疫印迹结果为依据，研究明确了Z-DEVD-FMK在CetB挑战背景下对EBNA1蛋白水平的保护作用，并与其作为半胱天冬酶3/7抑制剂的属性相一致。[3]

### ■ 2.2 Caspase-mediated AURKA cleavage at Asp 132 is essential for paclitaxel to elicit cell apoptosis

![004.png](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12303165/72de58f8656c50c53ea7b69a97a366be.png)

![005.png](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12303165/03986ae4d85f36544c1dfdf66760895c.png)

▲ (A) AURKA 蛋白结构域示意图，指示了关键的激酶活性位点突变（D132A, K141A, D294A 等）。(B, D) 免疫印迹表明，野生型（WT）AURKA 在特定条件下发生 D132 位点依赖性切割（产生 D132-cleaved 片段），而激酶失活突变体则阻断了这一切割过程；且该切割事件显著影响了下游 LANA 的表达及 PARP1 的稳定性。(C) 在稳定表达 YFP-AURKA（WT 或 D132A）的细胞中，使用多种激酶抑制剂处理，结果显示，特异性 AURKA 抑制剂（如 Alisertib 等） 能够显著抑制 AURKA 的切割（提示其作用机制依赖于激酶活性），而其他激酶抑制剂则无此显著效果。

Z-DEVD-FMK (T6005) 在本研究中被描述为caspase-3抑制剂，并被进一步指出还可抑制caspase-6、caspase-7及caspase-8。在以HEK293T细胞为模型、通过staurosporine（STS）诱导凋亡的实验条件下，Z-DEVD-FMK 阻止了AURKA的切割。该结果是在细胞处于凋亡状态时观察到的，显示出Z-DEVD-FMK 在STS诱导的凋亡背景下对AURKA蛋白水解过程的抑制作用。研究对Z-DEVD-FMK 的功能界定包括其对caspase-3的抑制活性，同时报告其对caspase-6、-7、-8的抑制效应，这一明确定义的靶向特征与在细胞水平观察到的AURKA切割被阻止的结果相一致。综合这些实验情境中的发现，Z-DEVD-FMK 在多种caspase上表现出抑制活性，并在HEK293T细胞接受STS诱导凋亡时，显示出抑制AURKA切割的作用。[4]

## ■ 3. 结语

Z-DEVD-FMK通过其DEVD识别序列和氟甲基酮亲电基团与半胱天冬酶-3的催化半胱氨酸共价修饰，实现选择性不可逆抑制。文献表明，Z-DEVD-FMK有效阻断半胱天冬酶-3/7介导的底物裂解，削弱凋亡执行阶段，同时允许上游信号事件正常发生。例如，其在LCL细胞中阻断CetB诱导的EBNA1蛋白下降，并在HEK293T细胞的STS诱导凋亡模型中防止AURKA切割，证实对多种半胱天冬酶的抑制作用。未来，Z-DEVD-FMK可作为精准化学探针，助力解析半胱天冬酶依赖及非依赖的细胞死亡通路，界定caspase-3活性的关键时间窗，并通过降低背景凋亡稳定实验模型。

## ■ 4. Q&A

Q1: Z-DEVD-FMK通过何种机制抑制半胱天冬酶-3？

A1: Z-DEVD-FMK通过其DEVD识别序列和氟甲基酮亲电基团与半胱天冬酶-3的催化半胱氨酸共价结合，实现不可逆抑制。

Q2: Z-DEVD-FMK如何影响CetB处理下的EBNA1蛋白水平？

A2: 在LCL细胞中，Z-DEVD-FMK阻断了CetB诱导的EBNA1蛋白下降，体现其通过抑制半胱天冬酶3/7活性保护EBNA1蛋白。

Q3: Z-DEVD-FMK除抑制半胱天冬酶-3外，还抑制哪些半胱天冬酶？

A3: Z-DEVD-FMK还抑制半胱天冬酶-6、-7及-8，证据包括其在HEK293T细胞凋亡模型中阻止AURKA蛋白切割。

## ■ 5. 参考文献

[1] Earnshaw WC, Martins LM, Kaufmann SH. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu Rev Biochem. 1999;68:383-424.

[2] Garcia-Calvo M, Peterson EP, Leiting B, Ruel R, Nicholson DW, Thornberry NA. Inhibition of human caspases by peptide-based and macromolecular inhibitors. J Biol Chem. 1998;273(49):32608-32613.

[3] Li Y, Du S, Zhou K, Zhang Y, Chen X, Zhu C, et al.. A small molecule that selectively inhibits the growth of Epstein-Barr virus-latently infected cancer cells. iScience. 2024;27(9):110581.

[4] Chen X, Du S, Zhang Y, Peng K, Liu L, Wang T, et al.. Caspase-mediated AURKA cleavage at Asp 132 is essential for paclitaxel to elicit cell apoptosis. Theranostics. 2024;14(10):3909-3926.

■1.背景介绍▲Z-DEVD-FMK(T6005)，CAS:210344-95-9Z-DEVD-FMK(T6005)，C

Z-DEVD-FMK: 选择性不可逆抑制半胱天冬酶-3，助力细胞凋亡机制解析

■1.背景介绍▲Z-DEVD-FMK(T6005)，CAS:210344-95-9Z-DEVD-FMK(T6005)，CAS:210344-95-9是一种细胞可渗透、选择性强且不可逆的半胱天冬酶-3抑制剂，其IC50为18μM。其作用机制基于四肽样的DEVD识别序列匹配半胱天冬酶-3底物偏好，并依靠分子中的氟甲基酮亲电基团与酶活性位点的催化半胱氨酸发生时间依赖性的共价烷基化，从

人工智能

Z-DEVD-FMK(T6005)是一种细胞通透性、不可逆的半胱天冬酶-3抑制剂（IC50=18μM），通过DEVD序列和氟甲基酮基团共价修饰催化半胱氨酸，阻断凋亡执行阶段。文献证实其抑制caspase-3/6/7/8，保护LCL细胞中EBNA1蛋白免受CetB诱导降解，并阻止STS诱导的AURKA切割，适用于解析半胱天冬酶依赖与非依赖细胞死亡通路。

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