默认情况下,DESeq2 使用 Wald 检验来识别在两个样本之间差异表达的基因。给定设计公式中使用的因素,以及存在多少个因素水平,我们可以为许多不同的比较提取结果。在这里,我们将介绍如何从 dds 对象获取结果,并提供一些有关如何解释它们的解释。
TCGA数据下载就易用性来说,RTCGA包应该更好用,且由于是已经下载好的数据,使用比较稳定。但是也由于是下载好的数据,不能保证数据都是全新的。TCGAbiolinks包是实时调用GDC的API,所以可以获取最新的数据。
在上一期奇怪的转录组差异表达矩阵之实验分组中,我们谈到DESeq2输出NA的问题,这周我们仍使用上周 GSE126548-分组差异并不大,这个数据集来进行分析
使用RNA-Seq分析肺癌患者原发肿瘤中的基因表达差异,比较了有脑转移和没有脑转移的两组患者,以寻找不同表达的基因和潜在的信号通路
工作流程完成后,您现在可以使用基因计数表作为 DESeq2 的输入,使用 R 语言进行统计分析。
差异基因鉴定 基因表达标准化 不同样品的测序量会有差异,最简单的标准化方式是计算 counts per million (CPM),即原始reads count除以总reads数乘以1,000,000。 这种计算方式的缺点是容易受到极高表达且在不同样品中存在差异表达的基因的影响;这些基因的打开或关闭会影响到细胞中总的分子数目,可能导致这些基因标准化之后就不存在表达差异了,而原本没有差异的基因标准化之后却有差异了。 RPKM、FPKM和TPM是CPM按照基因或转录本长度归一化后的表达,也会受到这一影响。 ca
本文目标: (1)使用edger包做TCGA数据库RNA-seq数据差异分析 (2)使用deseq包做TCGA数据库RNA-seq数据差异分析 (3)使用limma包做TCGA数据库RNA-seq数据差异分析 (4)如何在没有生物学重复的情况下(比如说只有两个样本,来求取差异基因)
基因芯片数据分析(六):DESeq2包的基本原理 我们接下来通过一个案例介绍利用edgeR进行差异分析。
今天小编给大家带来的是一个强大的火山图绘制工具--EnhancedVolcano,用户可以通过颜色、形状、大小、环绕和阴影等参数对火山图进行个性化的调节,并且可以有效地插入基因名,避免发生数据点重叠的情况。
关于TCGA的差异分析之前介绍过,不过略微有些不够完整,而且主要是演示的TCGAbiolinks这个包,对于DEseq2介绍的不够,所以今天专门说一下使用DEseq2进行差异分析。
在微生物组研究中我们常常需要根据某些感兴趣的表型来找到与其相关的特征(比如菌群、OTU、基因家族等等)。但微生物组学的数据结构导致了这必然是一项相当艰巨的任务,因为他们:
我们接下来通过一个案例介绍利用edgeR和DESeq2包进行差异分析,本文先介绍edgeR。
连续两次求贤令:曾经我给你带来了十万用户,但现在祝你倒闭,以及 生信技能树知识整理实习生招募,让我走大运结识了几位优秀小伙伴!大家开始根据我的ngs组学视频进行一系列公共数据集分析实战,其中几个小伙伴让我非常惊喜,不需要怎么沟通和指导,就默默的完成了一个实战!
DESeq2工作流程的下一步是QC,它包括样本级和基因级的步骤,对计数数据执行QC检查,以帮助我们确保样本/重复 看起来很好。
https://www.nature.com/articles/s41477-021-00897-y#data-availability
纵轴是基因,横轴是count数,这个图揭示了某个样本中所有基因的count数分布。
传统KEGG(通路富集分析)和GO(功能富集)分析时,如果富集到的同一通路下,既有上调差异基因,也有下调差异基因,那么这条通路总体的表现形式究竟是怎样?是被抑制还是激活?或者更直观点说,这条通路下的基因表达水平在实验处理后是上升了呢,还是下降了呢?由于没有采用有效的统计学手段去分析某条通路下的差异基因的总体变化趋势,这使得传统的富集分析结果无法回答这些问题。
给粉丝朋友们带来了很多理解上的挑战,所以我们开辟专栏慢慢介绍其中的一些概念性的问题,上一期: 箱线图的生物学含义
差异表达分析工作流程的第一步是计数归一化,这是对样本之间的基因表达进行准确比较所必需的。
主成分分析 (PCA) 在数据科学、生物信息学等多个领域具有广泛的适用性。作为一种数学降维方法, PCA利用正交变换 (orthogonal transformation)将一系列可能线性相关的变量转换为一组线性不相关的新变量,也称为主成分,从而利用新变量在更小的维度下展示数据的特征。
在下部分中,我们将研究如何使用 R/Bioconductor 识别开放区域中的变化。
因为没拿到raw counts,拿到的是DESeq2 normlized matrix,为了有谱,拿airway数据用DESeq2处理两次,看下结果,比较一下是不是可行! 可行性以及解释,各位看官,往下看; 纯代码: Step1、2数据处理和两次差异分析 rm(list = ls()) options(stringsAsFactors = F) ###matrix和phenodata提取 library(airway) data(airway) exprSet <- assay(airway) gro
这个文章做了 Differentially expression analysis of GSE199152 ,这个数据集 GSE199152 (3 RA-UIP, 20 IPF-UIP patients and 4 non-UIP controls) ,然后就可视化了 DESeq2, EdgeR and Limma packages were used to filter up-regulated DEGs
跟着存档教程动手学RNAseq分析(四):使用DESeq2进行DE分析的QC方法
差异表达分析工作流程的第一步是计数标准化,这是对样本间基因表达进行准确比较所必需的。
本期数据挖掘任务来自于Paper:Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer
这个有点丑的火山图对应的文章是:《In vivo transcriptional analysis of mice infected with Leishmania major unveils cellular heterogeneity and altered transcriptomic profiling at single-cell resolution》,如下所示 :
下面是去年实习生的分享 EnhancedVolcano包可根据差异分析结果,基于ggplot2绘图结构,方便地绘制美观的火山图,下面根据自己的理解小结下基本用法。 官方全面的教程:https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano 示例差异基因数据 library(airway) library(magrittr) data('airway') airway$dex %<>% relevel('untrt') ens <- rownames(airway) li
关于差异分析的文章中【一文就会TCGA数据库基因表达差异分析】其实有推送过,这篇文章目前为止,有近千人付费学习。
本章节我们的视频审查员(刘博-二货潜)将继续带领大家学习视频,并且复现附件中Figure S13的一张图,如下:
DESeq2 接受raw count的定量表格,然后根据样本分组进行差异分析,具体步骤如下
#没有任何提示就是成功了,如果有warningxx包不存在,用library检查一下。
UCSC Xena网址:https://xena.ucsc.edu/public-hubs/
这个包里可以画pca, 热图,火山图,韦恩图,具体每个图的算法,可以看生信技能树GEO芯片分析
当我们处理大量数据时,以图形方式显示该信息以获得更多信息,可能很有用。在本课中,我们将让您开始使用探索差异基因表达数据时常用的一些基本和更高级的图,但是,其中许多图也有助于可视化其他类型的数据。
一般来说可以用CV或者MAD来衡量某基因在某些样本的表达变化情况。 标准差与平均数的比值称为变异系数,记为C.V(Coefficient of Variance)。 变异系数又称“标准差率”,是衡量资料中各观测值变异程度的另一个统计量。 当进行两个或多个资料变异程度的比较时,如果度量单位与平均数相同,可以直接利用标准差来比较。 平均绝对误差(Mean Absolute Deviation),又叫平均绝对离差,它是是所有单个观测值与算术平均值的偏差的绝对值的平均。 用下面的代码可以看看,标准差,平均数,变异系
前段时间拿到一个RNA-seq测序数据(病人的癌和癌旁样本,共5对)及公司做的差异分析结果(1200+差异基因),公司告知用的是配对样本的DESeq分析。
在进行了前面两次的流程分析,目前已经得到了bedgarph文件和peak文件,需要在后面对peak文件进行相关的分析,主要有差异peak分析、peak的注释、注释基因的富集分析以及motif分析,我做了几次,发现里面的坑还是很多的。
使用library(DESeq2)加载的时候遇到报错 :载入了名字空间‘rlang’ 0.4.0,但需要的是>= 0.4.2 解决办法:将rlang包手动删除,rlang所在的路径是\R-3.6.1\library\rlang。然后使用命令install.packages("rlang")重新安装就可以了
分析转录组测序数据时,通常使用p值/q值和foldchange值来衡量基因的差异的表达水平。目前,大家普遍都认为转录组数据的read counts(即基因的reads数量)符合泊松分布。几个用于差异表达分析的R包如DESeq2和edgeR等,都是基于负二项分布模型设计的,整体而言结果相差不大。Limma包也可以用来分析RNA-seq数据,但主要用于分析芯片数据,现在用的人不多了。当然如果用泊松分布来做差异表达分析的话,也存在缺点,可能会忽视生物学样本间的个体差异。
我们一直以来都是给大家前面的两个方案,就是一定要先根据表达量矩阵做不同分组的差异,而且两者的结果一致性都还不错。但是前面的两个方案都会手动一个批次效应的影响,如果大家没有把握好其中的批次效应的去除,很容易在差异分析阶段就不小心引入了错误。
最近安排学徒做文献图表复现,其中一个表达量芯片和测序项目都是同样的处理和对照,所以让学徒做一下这两个表达矩阵的差异分析,比较一下不同技术是否有比较好的吻合。 其中测序是:https://www.ncb
在做项目时,曾有小伙伴对我用edgeR进行差异分析筛选出的具体显著差异基因表示质疑,因为发表的文章清楚的说明某个基因是差异基因,但是我edgeR的分析结果并没有表明。在小伙伴的质疑下,我认真看了下文章,发现文章用的是DEseq2进行差异分析。值得注意的是该小伙伴关注的差异基因是一个离散比较大的基因,此处的离散较大可以理解为假定对照组为5,6,7;实验组则为14,13,3的情况。那为什么这个基因在edgeR分析下不是显著差异基因,然而在DEseq2的分析下是差异基因呢?这应该很大程度源于算法判定显著差异基因的区别。接着,我看了关于DEseq2与edgeR区别的描述,发现「edgeR与Deseq2都是基于负二项分布模型做的,两者处理同一组数据时,相同阈值处理大部分基因是一样的,但是也会有一部分基因会因为离散度不同导致差异不同」,如刚刚示例的基因离散度被DEseq2识别为差异,但是不被edgeR识别,所以两种算法获取的差异基因与数目是存在细微区别的。
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