热门的数字等温扩增技术，如何选择合适的数字PCR平台？

本来想趁着2月份没那么忙系统学习下NGS，刚刚有点了解了mNGS，就又来了tNGS，而且仅金域在2022年就高达17万例检测。技术进步真是太快。

还是先得把PCR整明白，玩清楚才行。发挥死磕精神，一个产品一个产品写，一家公司一家公司研究。先把数字PCR盘起来。

01  等温扩增技术及主要厂家

等温扩增技术(Isothermal AmplificationTechnology)是在恒定温度条件下的核酸体外扩增技术，相比于PCR，不需要升降温控制，具有反应时间短、扩增效率高等优势。

常见的等温扩增技术有环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），链替代扩增技术(SDA)，解旋酶依赖性扩增技术(HDA)等，其中LAMP和RPA最为常用。

LAMP技术目前核心专利已到期，国内外多家原材料公司均有相关产品销售，而RPA的核心专利还在保护期内，目前国内也有可以替代RPA的专利技术产品，主要有ERA（先达基因）和RAA（众测生物）技术等。

02  数字等温扩增技术

数字等温扩增技术和数字PCR类似，即在等温扩增的基础上结合数字化的核酸检测技术，最早报道的数字LAMP是用微流控芯片进行试剂反应分隔，如2012年加利福尼亚大学伯克利分校的Luke P. Lee教授等基于LAMP技术在芯片上进行了数字LAMP测试，最低可检测20个拷贝的噬菌体DNA。

之后陆续的研究报道表明数字等温技术可以在30 min内完成检测，检测灵敏度甚至可以达到几个拷贝。数字等温扩增技术是一种高灵敏度、高准确度、高辨识力、高耐受性、可实现核酸直接快速定量分析的分子诊断技术，是现有核酸诊断技术的补充，其所具备的应用优势必将大大推动生物学研究、临床诊断、食品安全和环境监测等领域的发展，并有望形成规模巨大的新兴产业。

03  数字等温扩增特点

绝对（直接）定量：

通过样本的离散化分割，以阳性信号和阴性信号微单元的数量及比例来确定原始样本中目标核酸分子数，不需建立标准曲线即可进行精确定量

高（突变检测）灵敏度：

极微量的变异分子与正常分子被区分开来，使得稀有突变基因被单独检测，保证了更高的扩增特异性，灵敏度更高

（抑制剂）耐受性强：

通过把模板分散到各个反应微单元，能够有效降低抑制剂对扩增的影响

04  数字等温对检测平台的要求

当前的试剂并行分割技术主要有油包水液滴技术和物理分割的芯片技术，都已成功应用于商业化数字PCR领域，如国外原创代表性产品有Bio-Rad QX200（液滴发生卡）、ThermoFisher QuantStudioTM3D（硅基微孔板）和Qiagen（纳米微孔板），国内原创代表产品有小海龟科技 BioDigital系列（固态油隔水）和苏州思纳福DQ24（振荡注射）等。

数字等温体系和数字PCR体系相比存在一些差异，在平台选择过程中需要慎重考虑：

1） 等温扩增试剂相比PCR试剂，粘度大，液滴制备过程控制不易，相比于油包水方案，腔室分割的芯片式液滴技术更易进行控制、液滴稳定性和有效液滴比例更高；

2） 等温试剂由于在接近常温条件下即可以开始扩增反应，试剂配制后尽快完成液滴生成、尽可能减少初始反应时间（试剂配制与液滴生成之间的时间间隔）对于精准定量至关重要；

3)  多样本实验时，如不能同步进行自动化试剂配制，由于初始反应的存在，会导致定量结果的差异性，所以需保证每个样本的初始反应时间完全一致。目前为止，国内外尚没有合适的数字PCR技术平台完全解决以上问题。

05  小海龟解决方案

继2022年底发布全球首款芯片式全流程自动化（从初始的样本芯片上样到最后的输出分析结果）数字PCR一体机 “BioDigital·炎”，小海龟科技与四川大学华西医院专家团队联合研发并将推出一款能同时实现数字等温扩增功能的全自动数字PCR迷你一体机平台 SCI Digital。

该平台基于创新“固态油隔水”技术，可以把试剂体系完美分割到芯片的2万余个微腔室内。SCI Digital全自动一体机可以实现微滴制备前的自动化试剂配制、并能确保试剂配制后在最短时间内完成液滴制备，试剂配制到液滴制备完成少于2 min，且将匹配适合于数字等温扩增技术的FIFO（First in, First out）多样本自动控制方案，保证每个样本的初始反应时间完全一致。

因此，有望完美解决当前数字等温扩增技术的痛点和难点，加快等温扩增技术的前沿研究与产品开发，诚挚欢迎学界业界同行一起共同推动等温扩增技术快速进入数字时代！