摘要:本文提出了一种计算三维显微镜技术,称为可编程孔径光场显微镜(PALFM),用于荧光或自发光样品的无运动、高分辨率体积成像,该系统连接到现成的倒置荧光显微镜,其中环形孔径可以操纵类似贝塞尔的光束进行光谱调制。在大深度范围内对分辨率目标进行近衍射极限成像和小鼠肾脏切片的高分辨率、多色3D成像的实验结果验证了PALFM的有效性。HeLa细胞的体外高速、长期延时体积成像进一步表明,PALFM是一种很有前途的断层扫描成像工具,可用于研究动态细胞过程和事件,而无需复杂的样品旋转或光束扫描。
1 简介
光学显微镜为在细胞和亚细胞尺度上观察生物样品的精细结构和动态行为提供了一种强大的方法。通常,需要三维(3D)微观结构和功能采集,并且可以通过基于光-物质相互作用表征和获得与样品相关的光场来恢复。典型的技术,如随机光学重建显微镜可以通过操纵激发光实现点扩散函数调制或单分子定位,同时打破衍射极限分辨率。空间多路复用技术可以实现单次体积成像,但通常以降低空间分辨率为代价。
本文提出的可编程孔径光场显微镜(PALFM)的计算3D显微镜技术证明了使用环形孔径可以灵活地操纵无衍射的贝塞尔光束来调制入射光场,推导出了非相干傅里叶切片定理,该定理指出在环形孔径下检测到的强度信号等于物体光谱切片,揭示了环形孔径调制本质上可以将荧光宽视场显微镜扩展到非相干计算机断层扫描(CT)。
PALFM系统建立在现成的倒置荧光显微镜之上,在傅里叶平面上有一个空间光调制器(SLM),另一个4f继电器系统连接到显微镜的相机端口。这种可编程孔径模块可以灵活地改变等效光瞳,以调制成像系统和物体光谱的光传递函数(OTF),而无需机械扫描或介质变形。
本文通过OTF分析进一步研究了编码孔径方向图与成像系统分辨率和景深的定量关系,在此基础上,根据频率扩展和覆盖范围设计了由非中心对称圆形和环形孔径组成的混合孔径调制方案。在分辨率目标上的实验结果表明,PALFM可以使用0.45数值孔径(NA)物镜在40μm的深度范围内实现870nm横向分辨率和≈6μm 轴向分辨率的近衍射极限成像性能。通过PALFM对小鼠肾脏切片进行高分辨率、多色、无运动的体积成像,在两个数量级的成像效率下获得与共聚焦显微镜相当的结果。Henrietta Lacks(HeLa)活细胞的体外高速(≈1Hz)、长期延时3D观察进一步表明,PALFM是一种有效的显微断层扫描成像模式,用于研究细胞和亚细胞生物的形态和动力学,在开发和应用新型光学显微镜方面可能具有相当大的前景。
2 方法
2.1.基于孔径调制的PALFM成像模型
荧光体积成像面临的主要问题是低维到高维反向投影的模糊性。为了解决这个问题,本文提出了PALFM的成像模式。
图1 PALFM系统架构和断层扫描成像示意图
a)PALFM 系统建立在宽视场荧光显微镜上,其可编程孔径模块连接到显微镜的相机端口,其中SLM通过4f中继系统与物镜的瞳孔平面共轭。SAM:样品,OB:物镜,DC:二色镜,EXF:激发滤光片,EMF:发射滤光片,LS:光源,TL:镜筒透镜,BS:分束器,L:镜头,CAM:相机;b)环形孔径的3D-OTF分布,以展示投影到图像光谱的前向成像过程和背向投影到物体光谱的断层重建;c)直径较大的环形孔径的3D-OTF分布,以证明频率扩展;d)具有不同直径和旋转角度的环形孔径的3D-OTF分布,以及沿每个轴的光谱横截面;e)圆形孔径的3D-OTF分布,以证明相对于环形孔径的频率覆盖范围;f)具有不同直径和旋转角度的圆形孔径的3D-OTF分布,以及沿每个轴的光谱横截面。
传统成像系统的景深相对较小,尤其是对于荧光或非相干成像。使用环形光圈可以显著扩展景深。PALFM中的孔径调制理论上等同于显微镜CT,其中样品不相干地被照亮或自发光。当观察到的样品和照明光束保持静止时,可以通过后端孔径调制获得多向投影,而无需微观样品旋转和光束扫描。在这里,我们将其称为非相干傅里叶切片定理。
我们采用非相干傅里叶切片定理作为开发PALFM断层成像的基础。PALFM可以以全传感器分辨率对入射光场进行时间调制,克服了传统基于微透镜阵列的光场成像中通常不可避免的时空分辨率权衡。PALFM采用孔径调制来操纵物镜光束,以实现无运动、高分辨率的体积成像,而无需机械设备进行样品旋转或光束扫描。
2.2. PALFM的孔径调制方案
根据推导的非相干傅里叶切片定理,通过调制环形孔径可以获得具有不同法向的物谱切片。具体来说,环形孔径可以从不同的角度绕光轴旋转,以便背向投影的光谱切片可以逐渐填充物体光谱,如图1b的右侧所示。在这里,考虑了影响孔径调制与PALFM成像性能之间内在相关性的两个因素,即频率扩展和频率覆盖率,以设计用于PALFM体积成像的可选孔径调制方案。
本文设计的一种混合孔径调制方案,由具有不同直径和旋转角度的非中心对称环形孔径和圆形孔径组成。提出了一种用于混合孔径调制方案的迭代重建算法。虽然环形孔径获得了出色的深度辨别和大景深,但圆形孔径带来了高频覆盖率,实现了高质量的PALFM 体积成像。
3 实验结果
我们通过采用混合孔径调制方案对各种样品进行了PALFM体积成像实验证明。
3.1.分辨率目标的Palfm体积成像
从实验结果可以看出,混合孔径调制方案在40μm的深度范围内获得了870nm(第10组,元素2)横向分辨率和≈6μm轴向分辨率的近衍射极限成像性能。相比之下,当轴向位置超过10μm时,圆形孔径的空间分辨率会迅速降低。
图2 分辨率目标的PALFM体积成像
分别使用a)环形和b)圆形孔径序列,与聚焦分辨率目标相关的重建结果的3D渲染视图,以及两个轴位置的x-y切片和y轴投影;c)分别与(a)和(b)中标记的蓝线和红线相关的线廓;d)重建体积的MIP在z轴上的相关数据和拟合曲线;e)使用混合孔径调制方案和圆形孔径序列在代表性轴向位置放大的重建结果的局部视图;f)横向和轴向分辨率随轴向位置变化的直方图。比例尺,10μm。
3.2. 组织切片的Palfm体积成像
我们进一步实验证明了使用混合孔径调制方案对生物样品进行高分辨率、多色、无运动的PALFM体积成像。用3束不同波长的光束连续激发小鼠肾脏切片,并使用40×、0.95NA物镜进行成像。
四个扩大的感兴趣局部区域以及由绿色和橙色线标记的绘图轮廓清楚地显示了两种成像模式获得的一致形态分布和结构特征。共聚焦显微镜通常需要一个机械设备来驱动聚焦光束,以便对样品进行全局扫描,从而可以获得更深入的体素信息。PALFM可以通过灵活的孔径调制获得与共聚焦显微镜相当的结果,而无需机械位移,单通道成像时间为≈1s。然而,共聚焦显微镜的单通道扫描时间为≈5min,比PALLFM小两个数量级。
图3 小鼠肾切片的PALFM体积成像
a)肾小球部分的多色重建结果,沿z轴具有最大强度投影,沿两个垂直平面的x-z和y-z切片,由白色虚线标记;b)具有对应不同荧光染料和激发光束的相应颜色的3D渲染视图;c)与(b)中的第一个3D 视图相关的详细深度横截面;d)PALFM和共聚焦显微镜的比较结果与不同轴向位置的颗粒核的两个横截面有面有关,以及由黄色和橙色线框标记的几个局部扩大的感兴趣区域和由绿色和橙色线标记的线轮廓。比例尺,10μm。
3.3.活细胞的PALFM体积成像
PALFM还适用于通过可编程孔径的灵活调制对活细胞进行长期延时3D观察。在本实验中,体外HeLa活细胞制备为观察样品。摄像头的采集速率可以达到数百帧;然而,PALFM体积成像的速度(≈1 Hz)主要受SLF刷新率(60Hz)的限制。这种成像速度足以观察HeLa细胞的时空形态变化。通过PALFM对HeLa细胞进行成像。实验结果如图4所示。
图4 HeLa活细胞的PALFM体积成像
a)重建体积在不同时刻的3D渲染视图;b,c)不同轴向位置和力矩处的局部放大截面,对应于(a)中用白色线框标记的感兴趣区域。比例尺,10 μm。
图4的现象揭示了细胞凋亡过程,并表明PALFM是一种很有前途的断层扫描成像模式,适用于高速、长时间延时观察和研究动态亚细胞过程和事件。
4 讨论
在实现宽视场显微镜的光场调制和断层扫描成像功能的同时,可编程孔径模块仍面临一些问题。如果在孔径调制中进一步结合调制维度和编码策略,具有高时空分辨率的PALFM可能会扩展其潜在应用。PALFM可以与其他成像模式相结合,同时操纵照明和检测光束以进行多模态成像,进一步扩大了下一代计算光学显微镜的发展空间和应用范围。不同成像模式之间的内在相关性将是我们未来工作中值得深入研究的话题。
论文信息:
Cai, Zewei et al. “Programmable Aperture Light‐Field Microscopy.” Laser & Photonics Reviews 17 (2023): n. pag.
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