利用光散射与场流分离技术表征胰高血糖素聚集过程中的种子核

实验背景

胰高血糖素是一种肽类激素，其溶液易形成聚集体，导致凝胶化，影响药物稳定性。本研究通过光散射（SLS/DLS）和场流分离-多角度激光光散射（FFF/MALS）技术，探究初始溶液中的种子核（寡聚前体）对聚集过程的催化作用。

实验过程

样品制备

冻干胰高血糖素粉末溶解于0.01N盐酸或氢氧化钠中，经0.1-0.2μm过滤去除杂质。

使用紫外分光光度法测定浓度（278nm处吸光度）。

光散射分析

静态光散射（SLS）：通过德拜图（Kc/Rθ vs.浓度）计算重均摩尔质量（M_w）。

动态光散射（DLS）：分析自相关函数，利用CONTIN软件获得流体动力学半径（R_h）分布。

场流分离（FFF）与MALS联用

通过开放通道分离单体与聚集体，结合多角度光散射测定绝对摩尔质量。

验证方法时，使用牛血清白蛋白（BSA）等标准蛋白质优化分离条件。

实验结果

初始溶液中存在高分子量聚集体

SLS测得酸性溶液（0.01N HCl）中M_w为3539±372 g/mol，碱性溶液（0.01N NaOH）中为3831±275 g/mol，表明碱性条件下聚集体比例更高。

DLS显示未过滤溶液呈双峰R_h分布：1nm（单体）和100nm（聚集体）。

过滤对聚集过程的影响

过滤酸性溶液可去除100nm聚集体，显著延缓凝胶化（稳定达50小时），而碱性溶液过滤后仍残留61nm聚集体。

未过滤样品光散射强度随时间迅速上升，表明初始聚集体催化后续聚集。

FFF/MALS定量表征

FFF成功分离单体和聚集体，未过滤样品中检测到摩尔质量为1.2×10^5 g/mol的聚集体峰（占总质量1%）。

孵育22小时后，聚集体M_w增长至1.9×10^6 g/mol，证实其随时间显著增大。

结论

初始的胰高血糖素溶液主要是单体形式，但含有少量大聚集体。尽管这些初始聚集体的浓度较低，但它们能够催化或促使新的聚集体形成。通过过滤去除这些种子核可有效抑制聚集，这为药物制剂优化提供了关键依据。FFF/MALS技术的应用克服了传统色谱方法的局限性，为蛋白质聚集机制研究提供了高灵敏度分析手段。