石蜡包埋组织DNA提取困境何解？

很多研究者在进行石蜡包埋组织DNA提取实验过程中，常常遇到很多难题，譬如DNA片段断裂与降解、蛋白质交联导致无法提取出完整DNA、提取后进行PCR或RT-qPCR时扩增不出来目的片段等等问题，针对以上这些问题，我们一起来看看其中的原因与高效提取石蜡包埋组织DNA的解决思路。

一、石蜡包埋组织DNA提取难点

‌DNA断裂与降解‌：甲醛是福尔马林固定液中的主要成分，它在发挥固定组织作用的同时，也对DNA分子产生不利影响，甲醛会导致组织中蛋白和DNA的交联导致DNA链脆性增加，受机械剪切力作用后容易发生断裂。并且，在制备过程中，组织经过福尔马林固定和石蜡包埋，容易导致DNA降解。福尔马林在空气中氧化成甲酸，甲酸对DNA有较强的降解作用。此外，脱蜡过程中的脱蜡试剂也会导致核酸降解。

‌蛋白质交联‌：在石蜡包埋组织制备过程中，为了使石蜡更加牢固并保持切片完整，通常会使用加热、紫外线辐射或化学处理等方法固定石蜡，这会导致DNA与蛋白质交联。交联后的DNA分子难以提取完整，通常需要解交联步骤来解开交联的DNA、RNA和蛋白质。

‌抑制物产生‌：在提取过程中，存在着一些不能通过蛋白酶K消化和有机萃取法去除的PCR反应抑制因子，如某些染色剂小分子对DNA聚合酶的抑制，还有DNA严重降解后出现的大量寡核苷酸碎片，以及蛋白质、脂质等杂质残留。此外，脱蜡不完全或脱蜡剂残留也会对后续实验产生干扰。

二、石蜡包埋组织DNA高效提取策略

1、优化 DNA 提取：提取DNA过程中应尽量减少酚/氯仿法繁杂的操作程序，避免偏酸性的固定环境，以减少对DNA分子的额外损伤。研究者可以选择专为从福尔马林固定、石蜡包埋组织中纯化DNA而设计的试剂盒来进行提取，譬如Qiagen、BIOG的DNA FFPE Tissue Kit。

2、高效解交联：蛋白质解交联对于提取石蜡包埋组织样本中完整的DNA来说十分关键，传统的方式一般采用合适浓度硫酸过夜溶解或高温过夜温浴的方法，但整体时间较长，且硫酸具有强腐蚀性，不仅有较高的操作安全隐患还可能导致DNA遭到破坏。BIOG的石蜡包埋DNA提取试剂中含有专门优化的裂解液和消化液，可以快速彻底的去除DNA交联和已经降解的小片段DNA，最大限度地帮助释放DNA，显著提升DNA的提取效率。

3、去除抑制物：使用高效去污洗涤液去除抑制物，目前市面上有多种DNA提取试剂盒可以提供针对石蜡包埋组织中抑制物去除的专门解决方案，都可以有效去除血蛋自、脂质等其他干扰物，确保提取的DNA质量足够好，适合后续的分析。如果研究者不知道如何选择，可以优选有多年核酸提取试剂盒研发经验的品牌，诸如上述提到的两个品牌。

总之，石蜡包埋组织样本由于其自身的特殊性，在进行DNA提取前通常经历了长时间的保存，组织内部的DNA往往受到降解和断裂，杂质的含量也相对较高，因此采用高效的DNA纯化技术至关重要，选择合适的提取方法和专业的石蜡包埋DNA提取试剂有助于起到事半功倍的效果。