天冷了,照顾好自己!

摘在生态毒理学受试生物研究上,国内外已经开发了多种受试生物品种,如斑马鱼,大型溞,浮萍,虹鳟,反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息,为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术,克隆典型河蚬肠促胰酶肽(Cholecystokinin),Conopressin神经肽和FF神经肽基因,并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯,筛查敏感的神经肽标志物,为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制,为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种,陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因,如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中,我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况,两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标,本研究提供了河蚬miRNAs数据,为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖,养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取,然后在3’和5’接头加上测序序列,接着进行反转,建库,PCR扩增,使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA,加接头,最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤,评估序列质量去除低质量序列和3’接头,5’接头和多A序列,计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA,tRNA,snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇,按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇,用手轻轻上下翻转约50次,用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g,4°C下离心5min,尽量弃上清。 (7)室温瞭干,注意不要干燥过分,然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时,样品纯度符合要求,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA (1)用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL) RNA16μL DNaseⅠ2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL (2涡旋混匀后,37°C 水浴 30min。 (3)加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL,混匀,瞬时离心,65°C 反应 10min。 (4)RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量,使用Promeg

有一种朋友,虽远在天涯,

却让人心生眷恋,

有一种感情,虽若隐若现,

却让人温暖心间,

有一种关怀,虽时空虚幻,

却让人幸福满满,

有一种真心,虽朴实无华,

却让人惦记冷暖。

朋友,你在吗?

冬天已经到了,早晚天气很冷,

你要多穿点,

别总是要风度不要温度!

如果脚冷了,

去给自己买双带棉绒的鞋子,

穿着会很舒服;

出门前戴上围巾手套,

不要嫌难看~

一定记得要吃早点,

不然会又冷又饿。

要吃热的食物,喝点热牛奶,

少吃点稀奇古怪的零食,

那些东西对身体不好。

冬季气温低气候干燥,

嘴唇容易干裂出血,

平时你要多喝点热温水

就会好很多。

晚上不要熬夜超过12点,

要是出现黑眼圈会很难看的。

睡觉前泡个热水脚,

那样会加速血液循环,

消除你一天的疲劳。

少上网少玩手机,

不开心了,难过了,想我了,

给我留言吧,说出来会好受一些。

天气越冷,牵挂越深,

出外奔波的你,记得防寒,

疲惫回家的你,注意休息,

什么时候都要记得,

再苦也别难为自己,

再难也要保重身体。

寒风吹起,黄叶飞舞,

冬寒语暖,思绪万千,

向远方的朋友,轻轻的说一句,

“天冷了,照顾好自己!”

太里。人十五岁看“她”的时候,感觉青涩了,脸是很红的,有了很难抑制的心跳,有了很难改掉的习惯。有了坚持带着放弃,有了眼前带着长久,有了欲望带着迷茫,有了荷尔蒙带着波动,有了岁月带着青春,有了朝阳。也有种莫名的爱恋我二十岁看“她”的时候,感觉也并不是那么动人,只是这么个模样而已,倒是其“她”的更好看一我三十岁看“她”的时候,感觉没什么,原来世界那么大,美丽的还有更我五十岁看“她”的时候,无法再说什么爱不爱了,她就在我少年的时候留下了一道风景,那是我最原始的小心念,最留恋,最初恋我五十五岁看“她”的时候,如果人生的光阴能倒转,我还是愿意回到和“她”相对视的那天,只是说说你好,然后还是过客的行走姿势,你和我没有为彼此回过头,没有所谓的多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教室时并没有看到你的身影。那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教室时并没有看到你的身影。那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电话告多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教室时并没有看到你的身影。那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电话告诉我你路上有事耽搁了马上就过来,可我连一个消息都没等到。我诉我你路上有事耽搁了马上就过来,可我连多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教室时并没有看到你的身影。那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电话告诉我你路上有事耽搁了马上就过来,可我连一个消息都没等到。我一个消息都没等到。我话告诉我你路上多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教室时并没有看到你的身影。那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电话告诉我你路上有事耽搁了马上就过来,可我连一个消息都没等到。我有事耽搁了马上就过来,可我连一个消多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 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在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教室时并没有看到你的身影。那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电话告诉我你路上有事耽搁了马上就过来,可我连一个消息都没等到。我电话告诉我你路上有事耽搁了马上就过来多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教室时并没有看到你的身影。那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电话多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教室时并没有看到你的身影。那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电话告诉我你路上有事耽搁了马上就过来,可我连一个消息都没等到。我告诉我你路上有事耽搁了马上就过来多如果,一切都不偏不歧的发生了,初次见你,说实话现在已经记不清你那时候的模样,只记得一双咸猪手很不安分,没错,这就是对你的第一印象,咸猪手。第二次见面是你约的我吗?我已经记不清了,但是第二次见面就带我去酒吧好像不太好吧,也许你并不知道我不喜欢太吵的地方吧,反正去都去了就想跟你玩玩但深知自己不会喝酒也就不了了之了,然后到了我对你稍有好感的地方,没错,就是吃东西,当时没想那么多,就想着不吃白不吃反正我喜欢吃小龙虾,谁知道被你笑话了那么久,其实吧,我平时吃的不多,好吧其实还是有那么点多谁让我就那么点爱好呢。吃东西的时候我可以说相当随意在那之前在外面从没那么随便过,也许是当时真没想过要跟你在一起吧,但没想到的是你居然会向毫无形象吃相可怕的我告白,只不过你能解释一下你把我一把拉过去的时候顶在我小腹上的是什么吗?好吧,其实我知道是什么所以后退一步果断拒绝了你,首先我觉得刚认识就告白的人对感情不认识,其次告白都意淫的人恐怕也不是什么认真负责的人……后来你去了南昌,我们只能聊天,那时候我也许是闲得无聊也许是……总之很期待你发消息给我,当我意识到大事不妙的时候已经晚了,我不记得我们具体哪天在一起了你说二十号就二十号吧总之我们在一起了 在一起后第一次见面,好吧,我忘了。只记得后来下午吃饭的时间你会来找我也常来接我放学,每次我都好开心,但是后来你来的次数少了甚至干脆不来了,我们每个星期只能见一次可每次你都想去如家?当时我完全无法理解甚至一度认为你是为了性才追的我,我应该告诉过你我之前的事吧,那次对我打击很大,造成的心理阴影更是无穷大也是那时候我才明白原来谈恋爱不只是牵手拥抱和亲吻,但我无法接受所以他离开了我,我也就遇见了你,可当你提出那种要求的时候那种恐惧感被唤醒了所以我在抗拒我以为你会像他一样离开,可是你没有,那时觉得自己很幸运但我还是无法克服心中的恐惧,,,后来我们总是争吵你开始觉得我烦了你开始答应过得事情做不到了你开始冲我发脾气也不哄我了。你答应接我放学的那个晚上,快下课的时候同桌说你在外面说我笑的真蠢,可当我快速收拾好东西冲出教室时并没有看到你的身影。那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电话告诉我你路上有事耽搁了马上就过来,可我连一个消息都没等到。我,可我连一个消息都没等到。我,可我连一个消息都没等到。我那种失落无法言表,一路上我走的很慢把手机声音开到最大,我在等,等你打电话告诉我你路上有事耽搁了马上就过来,可我连一个消息都没等到。我一见钟情,你在你的世界里好,我也很好,谁也不知道说道:

无论您有多忙,请花1秒钟的时间把它放到你的圈子里!可能您的朋友就需要!谢谢!

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