ICH M7 指导原则下DNA反应性/致突变性杂质的控制水平

ICH M7 指导原则下DNA反应性/致突变性杂质的控制水平

Analysis of control limit of DNA reactive /mutagenicimpurities under ICH M7

作者

高广花，于春荣，李宏霞

王庆利，笪红远，马磊

国家药品监督管理局药品审评中心

四川大学华西医院国家成都新药安全性评价中心

摘要

药物中的DNA 反应性杂质水平应按照M7 指导原则中的策略进行控制。杂质的分类基础是已有的相关致突变性及致癌性数据，当特定化合物的数据缺乏时，则需借助于定性的结构活性关系( QSAR)信息来判断。

毒理学关注阈值( TTC) 的概念来自于FDA 对食品中所含的微量化合物的控制策略，由致癌性已知的物质的半数致瘤率( TD50) 暴露量线性外推至使肿瘤发生率增加1 /106 ( 早期临床研发阶段) 及1 /105( 药物研发较后阶段) 的杂质暴露水平，当DNA 反应性杂质水平低于TTC 时，由于杂质暴露导致肿瘤发生的额外风险是可以忽略不计的。

本文对化学药物中常见杂质及食品中微量污染物中的警示结构进行了比较和分析，并基于对M7 的理解对其暴露阈值提出了一些建议。

正文

ICH M7 指导原则中的目的在于指导如何对DNA 反应活性杂质进行评价和控制，内容涉及药学及药理毒理等多学科领域。

ICH Q3A，Q3B，Q3C，Q3D 等药学方面的指导原则对一般杂质的限度提出了控制原则， ICH S1，S2，M3 等药理毒理方面的指导原则对主药的遗传毒性/致癌性及其阶段性要求提出了要求。

但是，有DNA 反应活性的杂质因其在极低水平下即存在致突变/致癌风险性，其评价原则应不同于一般杂质及主要药效成分。

在ICHM7 正式发布以前，不同的地区和国家( 如欧盟EMA及美国FDA) 已先后发布了相关的指导原则或草案，为统一各成员国之间要求上的差异， ICH 发起并组织了M7 的制定工作，该指导原则针对DNA 活性杂质提出了较明确的评价及控制策略，M7 (R1)于2017 年5 月31 日发布，现已处于第四阶段，推荐到各成员国采纳使用。

我国药监部门已于2017 年6 月加入ICH，新药研发过程中对此类杂质的控制也要按此执行，本文就该指导原则中涉及到的几个重要的方面进行分析，以期对今后的药物研发及相关审评工作有所帮助。

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杂质的分类及依据

基于杂质致突变性及致癌性试验结果对杂质分类，建立对可能的及实际存在的致突变杂质或降解产物的评估和控制策略。其中致突变性的判定依据主要是细菌回复突变试验( Ames) 结果，致癌性则以动物致癌试验结果和人类致癌性相关证据( 主要来源于环境、食品及职业接触的研究结果) 来判定。

1.1主要通过数据库检索收集已有的相关研究数据

常用的数据库包括商用( 付费) 数据库和公开( 免费) 数据库，现将常用数据库的特点汇总，见表1。

1.2 结构-活性( QSAR) 分析

当没有足够的致突变性/致癌性研究结果，或无法获得这样的分类数据时，则应进行结构-活性关系( SAR) 预测和评估，其中应着重关注细菌致突变性的预测结果。

当无法获得杂质的致突变性/致癌性数据时，ICH M7 推荐采用2 种原理不同的软件系统( 以专家推理规则为基础的系统和以统计学为基础的系统)来预测杂质的毒性。

目前常用的以统计学为基础的模型系统有Leadscope Genetox Statistical QSAR( Leadscope Inc ) 、CASE Ultra ( MultiCASE Inc) 及Sarah Nexus ( Lhasa Limited) ; 以专家规则/知识为基础的模型系统有Leadscope Genetox Expert Alerts( Leadscope Inc) 及Derek Nexus( Lhasa Limited) 。通常建议选择最新版本的预测软件进行安全性预测。

可能影响预测结果的杂质结构特征包括警示结构周围的电子密度和空间环境及杂质分子的大小和形状等。在输入杂质特有的化合物信息后，软件自动与系统内的已有数据( training set) 比较，根据其结构相似程度，判断是否存在警示结构。

统计学为基础的系统基于概率参数给出结论，专家系统可以依据Ames 试验的菌株、试验浓度设置等模仿专家的判断过程给出结论。2 个系统都受数据库中数据质量及知识产权保护程度的影响，当待测物的分子空间加大时，预测的准确度降低。

由于公开的结构多半是小分子，产权保护的结构多为相对分子质量较大且结构较复杂的物质，因此应当谨慎地选择数据库及模型参数，且结合专业背景进行合理的评估。

ICH M7 明确提出要给出2 个模型系统的评价结果，依据研发的阶段，QSAR评估报告可包含下列信息: ① 方法学描述: 软件、模型、数据库、参数及版本信息等。② 有专家评估的结果汇总: 软件鉴定出有意义的杂质的化学结构特征与致突变性试验阳性的结构功能团的相关性; 基于模型预测及专家评估( 有/无致突变性) 的结论及分类。③ 支持性信息:支持或反驳QSAR结果的专家意见，可用案例或参考文献举证; 尤其对4 类及5 类杂质的综合性结论应提交支持性信息。④ 附录: 上市申请时应提交支持性的完整的细菌致突变性试验报告。

1.3在上述检索及模型预测的基础上，将杂质进行分类，按类别对DNA 反应性杂质进行控制

见图1。

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M7 中杂质控制策略的起源

2.1 毒理学关注阈值( TTC) 产生的背景

TTC 是由美国FDA 在20 世纪90 年代针对食品监管问题提出概念，为间接引入食品的添加剂( 如包装材料人体摄入) 采用阈值管理提供了科学依据，并逐渐被世界粮农/世卫联合的食品添加剂专家委员会( Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)接受，用于食品添加剂的安全性评价。对通过饮食途径使人体低水平暴露( 低于每人1.5 μg·d-1，相当于0.025 μg·kg-1BW·d-1) 的食品包装材料成分，不要求进行大规模的毒性测试，重点关注摄入量的评价。

TTC 定义了未经安全性研究的化学物质在致癌性或其他毒性方面的可接受摄入量。确定TTC 的方法总体上认为是非常保守的，它是将50% 肿瘤发生率( TD50) 对应的剂量简单线性外推到百万分之一的发生率而得，而且采用的TD50数据取自最敏感动物和最敏感的肿瘤诱导部位产生的数据。在使用TTC 评估致突变杂质的可接受限度时，宜采用1.5μg·d-1的安全阈值，它理论上对应的是额外增加1 /105 的患癌风险。

对于新药研发的早期，由于受试者的获益尚不能确定，建议采用0.15 μg·d-1的安全阈值。已有研究显示，有些结构基团具有更高的致癌性，即使摄入量低于TTC，理论上仍会具有高致癌风险。这类高效致突变致癌物，被称为“关注队列”，包括黄曲霉毒素类、N-亚硝基化合物，以及烷基-氧化偶氮基化合物。

美国FDA 食品安全部门Cheeseman 等从90 年代开始发表文章，介绍应用警示结构来评价接触食品的化学物质的潜在致癌性，通过一系列的阈值来分层控制风险较高的化学物质，即将风险控制在肿瘤发生率在背景水平上增加不能超过1 /106，这种条件下的暴露水平即定为可接受的阈值。

2004 年欧洲专家组( 丹麦、荷兰、瑞士、英国及德国) 及美国FDA 发表了“以结构为基础的TTC: 应用于饮食中低水平化学物质控制的指导原则”，该指导原则中选取了数据库( gold carcinogenic potencydatabase) 中703 种及其他来源共730 种化合物，将其中化学物质致癌试验中得出的TD50线性外推得出额外肿瘤风险( 以下同) 为1 /106 的临界值，据人的平均摄入量来推算可接受的每日摄入量( ADI，μg·d-1·人-1) ，不同的结构类别得出的阈值不同( 表2) 。

值得提出的是，某些结构类别，在最低摄入水平( 0.15，0.002 5 μg·kg-1·d-1，60 kg，BW) 时即产生高于1 /106 的肿瘤风险，这类结构被确认为高致癌性结构，称为关注队列( Cohort of Concern，COC) ，如黄曲霉毒素、亚硝基类、氧化偶氮类、类固醇类、多卤代-二噁英及二苯呋喃类等5 类化合物，其中类固醇类及多卤代-二噁英及二苯呋喃类为非遗传毒性致癌物，显示了有阈值的剂量反应关系，因此不能用线性外推法进行理论上的推算，其风险评估必须采用化合物本身的安全性数据，最终确认的COC 队列包括黄曲霉毒素、亚硝基类、氧化偶氮类，TTC 外推计算原理不适用于这类物质。其他具有警示结构的化合物用基于动物剂量反应关系线性外推的方式计算得到TTC 水平。

该研究发现，与神经毒性、生殖毒性及内分泌干扰毒性指标相比，基于肿瘤发生率的TTC 是最保守的评估方式，适用于长期低水平摄入化学物质的风险评估。

2.2 TTC 概念的应用

当化学物质本身的毒性资料缺乏时，可以基于已有的大范围的化合物的毒性研究数据，采用TTC 的概念来评价该化合物的低水平暴露的风险。按照TTC 的原理可以避免过多的不必要的大范围毒性研究，可以更有效的利用有限的时间、动物、资金及专业人员的精力。因此消费者( 患者) 、企业及监管部门均可受益。

2006 年，欧盟药品管理局( EMA) 首先在其发布的遗传毒性杂质研究指南中采用了TTC 的概念，2008 年美国FDA 提议接受，日本没有相关指导原则，ICH M7 在2014 年发布终稿，随后EMA 及美国FDA 的相关指南即由M7 替代。

2.3 药物合成中常见的杂质

随着新药研发的进展，药物活性成分( API) 日益增多，杂质结构也越来越复杂。Galloway( 美国默克研究实验室) 2013 年发表的文章中，分析了13 个跨国大型制药企业108个合成路线中的杂质，共发现了602 种警示结构，作者比较分析了这些警示结构类别与CPTB 数据库中化合物警示结构分布的区别( 见表3) ，结果显示，药物合成中出现杂质的警示结构类别及比例可能不同于CPDB 中的相关信息。

在药物合成路线中出现频率最高的警示结构( 占总警示结构的60%) 包括烷化剂; 芳香胺、胺、酰胺及N-羟胺类化合物; 以及芳香硝基衍生物，具有这些警示结构的化合物在CPDB 数据库中的比例也较高( 近50%) 。

合成路线常见但CPDB 中较少的化合物类别有酰氯( acid chloride) 及其衍生物、烷基醛及亚硼酸( boronic acid) ; 亚硼酸近期被认为是致突变剂，此类物质大多Ames 试验呈弱阳性，且大部分缺少致癌性信息。最大的区别为CPDB 中有大量的高致癌活性属于关注队列( COC)的N-亚硝胺类化合物，药物合成中却很少出现。

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致突变性或可能致突变性杂质的控制策略

一旦有警示结构或致突变性化合物进入合成路线，就要确认后续的工艺过程是否能将其清除; 如果不能肯定是否能清除，就需要建立一个可接受的限度。

对已知的致突变性致癌物，应采用化合物特有的ADI 的计算; 对有警示结构但致癌性未知的致突变物质，建议采用默认的TTC 作为保守的限度水平; 如有同类别的预警结构，适当的情况下可参考同类别警示结构的限度水平。

3.1 化合物专属的限度水平

如果有确认的证据，杂质有致突变性及啮齿类致癌性研究数据，或者有流行病学资料，即可建立化合物专属的控制限度，当前版本的ICH M7 (R1) 中给出了14 种杂质的AI或PDE，阐述了不同杂质的制定限度的依据，包括化合物的作用机制、研究数据的来源、可靠程度及计算的方式，随着新药研究数据的增加及研究结果透明度的增大，估计ICH 将会发布更多的化合物专属的杂质安全性数据。

3.2 COC 关注队列物质

COC 队列包括黄曲霉毒素、亚硝基类、氧化偶氮类，在食品领域首次引入TTC 概念并计算TTC 时，该类物质因为高致癌强度并未包括在作为计算依据的数据库范围内，早期EMA 相关指导原则中就已指出，TTC 对这类物质是不适用的。当用1 /105 的风险水平时，这类物质的致癌强度( TD50) 低于1. 25 mg·kg-1·d-1( 50 kg 体重，1.5 mg·kg-1·d-1) ，这些化合物均采用化合物专属的控制限度。

Powley分析了这类杂质与药物合成路径中产生的杂质类别的关系，认为黄曲霉毒素类物质通常不应出现在药物合成路线中; 亚硝胺( N-nitroso)类化合物如果出现，应用化合物专属限度控制，可能高于或低于默认TTC; 对于未知致癌强度的亚硝胺类及烷基偶氮类化合物，还没有明确的计算方式得出可接受限度，应尽量避免出现在API 或药品中。

COC 类别中的偶氮类化合物应为烷基取代的偶氮类物质( alkyl azoxy compound) ，特性应不同于药物合成中经常产生的芳香基化合物( aryl azoxycompound) 。烷基偶氮物可以形成碳阳离子使DNA烷基化产生致癌性，如氧化偶氮甲烷代谢成甲基氧化偶氮甲醇，后者通过酶或非酶代谢方式进一步转化为烷基偶氮类代谢物质，终形成碳阳离子使DNA烷基化产生致癌性。

这些化合物多为低分子量烷基偶氮化合物，Ames 试验显示阴性/弱阳性/结果不一致，多不能提示出明确的致癌性预测结果。但是在药物合成路线中，经常出现的却是芳香偶氮化合物，在DEREK 预测模型中，芳香偶氮结构为致突变性的警示结构，该类物质Ames 试验结果不一致，未见大量的致癌性研究信息，未显示出类似烷基偶氮类的致癌性机制( 相似代谢活化通路，形成碳阳离子等) ，作者认为这类化合物已知/无致突变性研究结果时，均可考虑采用TTC 的控制原则。

3.3具有致突变性警示结构但未知突变剂/致癌性的杂质

在确定化合物专属的可接受限度时，需要有足够的数据计算ADI，但实际操作过程中经常存在安全性数据和机理上的不确定性。这种情况下，可以将已知化合物的可接受摄入量应用于化学结构相似的物质，但前提是必须有该杂质与已知化合物化学结构相似的依据。

据杂质结构功能团的类别判断与已知致癌性强度的化合物的相似性，来推算未知致突变性/致癌性的杂质的暴露可接受水平是有很大挑战性的，因为分子结构微小的变化可能导致生物活性较大的变化，即使一个相同化合物的类别其致突变性/致癌性强度变化范围也较宽，应建立在对其结构及与致突变活性的关系较充分了解的基础上来判断与已知致癌强度的化合物、化合物类别及亚类的关系，来得出可接受风险的控制水平。

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短于生命周期的TTC 计算( LTL)

已知致癌物的风险评估方法是假定患癌风险与累积摄入量呈正相关。因此，生命周期持续低剂量水平暴露和短时间内较大剂量的累积暴露对于肿瘤增加的风险是等同的。TTC 为1.5 μg·d-1的水平( 相当于增加1 /105 的患癌风险) 为可接受的整个生命周期的安全暴露水平。据此计算，整个生命周期( 以70 年计) 的摄入总量为1.5 μg·d-1×365 d × 70 年= 38. 3 mg，短于生命周期的暴露即将该水平平均分配到给药的阶段中来计算( 表4) 。

对于间断给药的情况，应考虑总的给药天数，例如2 年间每周1 次服药( 应按104 d 计算) ，其可接受的摄入量为20 μg·d-1( 按表5 中用药1 年的剂量) 。

如已有化学物质致癌性研究结果，判断结果的可靠性，选择设计完善、结果合理的研究结果，最敏感的种属、最敏感的部位、与人类最相关的结果所得出的TD50来计算ADI。

M7 指导原则中列出了具体的ADI的计算方法，如在动物1～2年研究中生命周期的TD50为1.25 mg·kg-1·d-1，引起1 /100 000肿瘤发生率的剂量为TD50 /50 000( 0.025 μg·kg-1·d-1) ，对人的TTC为1. 5 μg·d-1(0.025μg·kg-1·d-1，60kg) 。

尽管首次计算TTC 时用60 kg 人平均体重，但目前ICHM7 指导原则中用50 kg 平均体重来计算潜在致突变性杂质的特有的ADI 水平。

化合物专属的限量标准也可选用剂量反应关系的BMD10 ( 导致啮齿类肿瘤发生率不高于10% 的95%置信区间的最低值) 来代替TD50来计算ADI( BMD10 /10 000) ; 或采用其他公认的组织如WHO公开发表的最新数据中推荐的限度值。

杂质为单个成分时，需考虑临床试验期限、适应症，按上述原则得出ADI。多个成分时，除上述控制外，总量也应进行控制，在原料药质量标准中，只有列出的2 类和3 类杂质才会被包括在总限度计算中，而特定化合物或按可接受摄入限度分类( 第1类) 的杂质不应计入第2 类和第3 类杂质总限度，原料药中形成的降解产物要单独控制，不能计入总限度。

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讨论

ICH M7 的适用范围为DNA 反应活性杂质，该类杂质在低浓度下即可能造成DNA 损伤，导致突变，因此具有诱发肿瘤的潜在可能性。

该指导原则中提出了杂质分类标准，其基本依据主要为Ames试验结果。警示结构也是以Ames 试验结果作为主要依据。因为这类结构与Ames 试验结果之间的相关性较好，因此可以采用计算机模型进行预测。当不能获得化合物专属的安全性信息时，可以部分地依据预测的结果来制定杂质安全限度。

在M7 指导原则起草初期的概念性文件中，工作组提出了当时面临的诸多问题，如评价致突变性警示结构的方法、早期临床研究/上市药物( 包括不同用药周期的药物) 的杂质控制水平、是否需要对已上市药品进行回顾性的致突性杂质再评价、如何计算有阈值或非线性剂量反应关系的可接受水平、是否结构相似杂质应合并计算TTC、高于默认TTC作为可接受的限度时需要什么信息支持等等，这些问题在最终定稿的M7 中均给出了较明确的解决方案。

我国DNA 活性杂质的控制策略应符合M7 的相关要求。M7 指导原则的实施为企业提供了一套可行的致突变性杂质控制策略，对监管部门在数据支持程度不同的情况下，既能依据已有的信息保证受试者及患者的健康利益，同时又能推进药物的研发提供了一套科学的评价方式。又因新药研发及审评中杂质的评估涉及到药学及药理毒理学专业人员协作进行，在直接支持数据缺乏时，需要企业及监管部门之间加强沟通交流以达成共识。

M7 的实施对研发及审评人员的跨学科知识提出了较高的要求。药学专业除了要关注杂质的结构确认及含量分析之外，还要了解结构与活性的关系，有识别警示结构的常识; 毒理专业人员要了解化合物的结构类别、致突变性/致癌性的可能作用机制及总体对这类杂质的安全性控制要求，达到既能控制风险又能节约动物及人力，提高研发效率的较理想的结果。

本文在对M7 指导原则及公开发表的文献进行综述的基础上，对致突变性杂质的分类及控制策略及背景信息做了介绍，希望对企业的研发及今后的审评提供一些参考及帮助。但因化合物类别复杂，合成途径多种多样，致突变性及致癌性的研究数据相对有限，QSAＲ 模型预测过程中存在一定的不确定性因素，所以具体的杂质限度还需建立在数据是否充分，判断是否具有科学性的基础上，需企业与监管部门不断沟通以达成共识，共同制定出切实可行的控制策略及接受限度。