GSH/GSSG 的检测原理和实验方法 | MCE原创

蒙家人们了解谷胱甘肽的检测吗？今天我们就来学习了解一下。谷胱甘肽是一种广泛存在于生物体内的还原性物质，可以用于评价氧化应激水平。GSH通过直接还原细胞质蛋白中的二硫键，维持蛋白球基处于还原状态，同时GSSH被氧化生成谷胱甘肽二硫化物mce的GSSHGSSHG是基于DTNB被还原生成显色物质TNB进行检测的。实验流程主要包括四部分，首先配置实验所需的溶液，并按照说明书的要求进行分装储存，其中掩蔽剂是在检测GSSG含量时使用。用于封闭GSH在准备样品时加入，而淬灭剂是为了防止谷胱甘肽被继续氧化或还原。在酶反应完成后准备检测时加入试剂盒可以检测的样本包括细胞、组织、血浆等新鲜样本。

接下来我们就可以分别进行总谷胱甘肽和GSSG的检测了。检测时先制作标取，用酶标仪测定412nm处吸光度，每25秒采集一次数据，连续检测15~20次。将采集到的数据导出到Excel表格中或者graphpad prism首先计算斜率，K值可以通过slope函数直接得到，或者通过图表获取斜率。以浓度为横坐标，斜率为纵坐标制作散点图，得到标取公式。样品组测得的数据需要先计算得到斜率，再代入标取公式回算出对应浓度，比较不同处理组的氧化应激水平。实际检测时没有加眼闭剂的样本，测的是总谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽等于总谷胱甘肽碱氧化型谷胱甘肽乘2。在实验过程中大家会有疑问，GSSH与DTNB反应后产生的GSSHG会在生成循环生成GSSH吗？实际上会存在少量循环。所以采集数据时采用动力学法，斜率与GSH浓度成正比，通过斜率预估总谷胱甘肽浓度。

也有同学会遇到计算结果是负值的情况，一般情况下，GSH的结果是正值，出现负值要先排除测定误差，数值为负，也可能是样品储存裂解过程中GSH被氧化，样品预处理过程尽可能快速，且保证0~4°C操作。