FNIRS研究：陌生气味竟可以引发新生儿的疼痛感受

研究者将这些婴儿暴露于来自于医院环境中的嗅觉刺激中，然后记录这些婴儿的反应。在给婴儿使用口服葡萄糖液以后再重复该记录过程。研究者使用fNIRS记录婴儿的嗅觉皮层、额叶皮层以及躯体感觉皮层的激活反应，通过录像分析痛感引起的行为反应。结果发现：疼痛得分和皮层激活程度呈正向相关关系；口服葡萄糖会抑制疼痛反应和皮层激活；在和大脑发育成熟有关的皮层整合以及宫外经历的持续时间上呈现发展差异。总之，早产新生儿和足月新生儿在暴露于能引起疼痛的陌生气味中后三叉神经会表现出一定的敏感性，从而影响新生儿大脑神经环路系统。

【注解：将早产儿暴露于由保健品释放的气味中时，会引发交叉神经系统和嗅觉系统的反应。众所周知，刺激成人的鼻粘膜会使之感觉到疼痛。】

研究方法 被试

一共有44名新生儿，包括15名早产新生儿（VPT），12名年龄相当的早产儿（VPT at term-equivalent age）以及17名足月新生儿（FT）作为控制组参加了这一次的实验。所有的新生儿都来自卡洛斯林卡医学院的新生儿重症监护室（NICU，neonatalintensive care unit，这里的婴儿会得到充足感觉刺激），出生于2013年2月到2013年11月之间。那些具有明显先天异常或者是大脑损失的婴儿，以及在实验前48小时内使用了止痛剂和或者镇痛剂的早产新生儿均无法参加此次试验。被试的具体信息见表1.

嗅觉刺激

研究者根据医院里气味的不同水平以及NICU中婴儿可接触到的气味情况选择呈现三种气味——稀释过（1:6）的洗手液味道、未稀释过的洗手液味道以及胶布清除剂的味道，在控制组中使用纯净水。正式实验开始之前，研究者先在成人组中测验了洗手液应该被稀释的程度以确保能够让婴儿感受到一定强度的嗅觉刺激。

在婴儿结束喂养至少30分钟以后对其进行测试，将其置于一个使用标准化程序处理过的房间中，灯光保持昏暗且没有任何噪音。根据Prechtl在1974年对婴儿睡眠的分类，研究者在婴儿睡眠的阶段二（不规律呼吸、快速眼动、眨眼等特征）对其分别呈现不同的嗅觉刺激物。具体做法是在距离婴儿鼻孔1cm处分别随机放置长度为20cm在密闭瓶中浸泡过不同溶液的棉花棒，棉花棒的放置时间为10秒，不同气味刺激之间的时间间隔是2分钟。在所有的气味呈现一次完毕以后，口服浓度为0.25ml的葡萄糖液，2分钟之后再次呈现未稀释过的洗手液、胶布清除剂以及清水。

行为以及生理数据记录

所有的实验试次都使用两台摄影机同时记录婴儿的身体反应和面部表情反应。记录时长为50秒，10秒作为基线、10秒呈现时间另外包括30秒的呈现后时间。实验采用双盲设计，有关的婴儿医护人员均不知实验的真实目的。实验中使用修订版的被证明效度良好的新生儿面部表情编码系统（NFCS），采用“0”、“1”计分（0代表没有出现，1代表出现了）：眉毛下垂、眼睛挤压紧闭、鼻唇沟加深以及嘴唇张开。当这四项得分相加的平均数大于1时即可判断为婴儿的疼痛行为出现。其它诸如心率、呼吸率和氧饱和度等生理指标使用Radical 7和 GE DASH-4000监测器进行监测。

fNIRS测量方法

实验中使用NIRScout(NIR× MedizintechnikGmbH)记录婴儿的皮层反应，定位参照10–20 EEG系统，在婴儿头部两侧一共放置8个可以序列点亮的发射光极和4个接收光极，每一侧有四个通道，一共有8个不同的通道，采样率是6.25赫兹。

兴趣区的选择主要集中在三叉神经通路（疼痛感受）和嗅觉传导通路上。嗅觉信息加工和初级嗅觉皮层和次级嗅觉皮层有关。研究者选择初级嗅觉皮层（OC）部分区域、以及额叶尤其是额中回作为兴趣区。OC位于眶额皮层和梨形皮层之间，所以可以将发射光极放置在T3/T4靠前处，接收光极放置在C3/C4靠前位置处。额叶区域通过将发射光极放置在F3/F4稍微靠前和靠下位置处，接收光极放置在C3/C4靠前位置处。除此以外，我们还记录了和疼痛反应有关脑区——初级感觉皮层和次级感觉皮层（SCa）和顶下叶（SCb），该区域和躯体感觉加工有关）的血氧变化，因此发射光极放置在C3/C4的上方和下方，接收光极放置在T3/T4的上方和下方。

为了保证测量具有不同胎龄和头围大小的婴儿被试个脑区皮层的准确性以及让婴儿在戴上光极以后有一定的舒适性，研究者对婴儿定位时参考提前做好标记的10-20系统，使用个性化的电极帽。光极与光极之间的距离（IOD）因头围大小（头围大小范围在26-36cm）的变化而变化: 26cm (2.5 cm IOD)——2名婴儿,29 和30.5cm (3 cm IOD)——11 名婴儿,32 cm (3.5 cm IOD) ——3名婴儿,35 和36 cm (4 cm IOD)——28 名婴儿。

图1表示的是FT（左图）和VPT（右图）的光极放置，浅蓝色矩形代表的是不同的通道，SCa代表的是初级感觉皮层(SCa-Left:E1-R1,SCb-Left: E2-R1, OC-Left: E3-R2, FC-Left: E4-R2, SCa-Right: E5-R3,SCb-Right: E6-R3, OC-Right: E7-R4, FC-Right: E8-R4).

fNIRS 数据处理及分析

本研究中得到的实验数据处理使用的是基于Matlab2007b环境下的NiLab软件进行的(NIR× Medizintechnik GmbH) ，首先通过低通滤波（1HZ）去除高频噪声与心率信号和高通滤波（1/240HZ）处理来去漂移。接下来，使用修正过的朗伯比尔定律（Beer-Lambertlaw）对原始数据进行处理计算出HbO2和HHb的相对变化。记录不同婴儿的HB02和HHB浓度最大变化值的范围（和基线相比，-10s-0s），将分析时间窗定为0到30秒（这是根据前人对婴儿嗅觉及痛感的研究确定的）。头动数据处理的标准参照之前的严格程序(Lloyd-Foxet al.2010; Gervain et al. 2011)。最终，研究者通过将6.25赫兹的采样率减少到2.08赫兹，将3个连续时间点数据做了均值化处理，合并为一个数据点。HbO2 和 HHb也做了正态化处理。所有的数据在处理前均需要做正态化检验，对整个时间窗中（-10-30s）的数据采用重复测量的单因素方差分析，以及Newman–Keuls事后检验。所有的皮层激活图使用nirsLAB v201412进行绘制。

研究结果

气味暴露以后的皮层激活

对所有新生儿被试的分析

和我们的实验预期相同的是，暴露在纯水条件下没有观察到相应地皮层血氧变化。未稀释过的洗手液和稀释过的洗手液在所有的痛觉皮层都出现显著的激活，4个嗅觉区域中至少有两个出现激活（如表2）。胶布清除剂条件下也在一个疼痛区域出现显著激活和一个嗅觉区域出现边缘显著的激活。

表2表示的是44名婴儿被试的HbO2平均信号变化值的单因素方差分析结果。:F值代表的是效应量大小，P值是显著性水平，通道位置同图1.

图2表示的是对所有新生儿的分析中激活的脑区。左图代表的是在稀释的洗手液气味条件下HbO2和HHb在左侧嗅觉皮层的变化，右图代表的是HbO2 和HHb在右侧次级感觉皮层中的变化，灰色的区域横坐标代表刺激呈现时间，垂直条形图代表的95%的置信区间。

图3.表示的是在未稀释过的洗手液气味条件下每秒时间内的血氧变化（HbO2和HHb，单位是μmol/L），图A代表的是VPT新生儿结果图，图B 是FT 新生儿结果图,图C是满月VPT结果图.一星表示脑区激活在0.05水平上显著，两星代表的是使用Newman–Keuls事后检验方法时在0.05水平上显著。

对不同实验条件下的新生儿被试分析

正常新生儿（FT）在未稀释的洗手液气味条件下只有疼痛感受区域双侧出现激活反应，而在稀释洗手液条件下疼痛感受区域和嗅觉皮层均出现激活反应。而对于VPT新生儿，在未稀释洗手液气味条件下疼痛区域有一个地方出现激活，稀释过的洗手液气味条件下疼痛区域和嗅觉区域均有一个地方被激活，胶布清除剂气味条件下嗅觉和痛觉区域双侧均出现激活。

满月VPT在稀释和未稀释过的洗手液气味条件下均在嗅觉皮层出现激活反应，稀释的洗衣液气味在痛觉皮层造成了HbO2值显著的双向变化。胶布清除剂条件下在痛觉皮层和嗅觉皮层区域均出现显著激活。

通过计算显著激活区域中通道较于基线值变化的平均值，结果发现在FT组中(6.3± 4.9

μmol/L)血氧反应值显著高于VPT组(4.2± 3.1 μmol/L, P < 0.001)。同时研究者发现在IOD和HbO2平均变化值之间没有显著关联（r=0.1049;p=0.503）。

气味暴露以后的疼痛反应

疼痛感所引发的行为

疼痛行为评分间的一致性系数为0.918，科恩卡帕值为0.52。三种气味儿条件在呈现时和呈现后阶段均比纯水条件下更能显著预测NFCS得分(未稀释洗手液气味条件：F= 3.4, P < 0.001, post hoc test: P < 0.001;稀释洗手液气味条件:F = 3.3, P = 0.011, post hoc test: P< 0.001; 胶布清洗剂条件下：F= 3.26, P = 0.012, post hoc test: P < 0.001)。在未稀释洗手液气味条件的NFCS值(P= 0.002)和稀释洗手液气味条件下NFCS的最大值显著高于（P=0.02)胶布清除剂条件下的值,但是稀释和未稀释的洗手液气味条件之间没有显著差异（P= 0.32）。研究者计算每一个婴儿被试在所有气味条件下的NFCS最大值的平均数然后比较组间差异，发现在疼痛行为上没有显著差异，具体如图4。

图4.由NFCS决定的疼痛行为.图A代表的是在5个不同的时间段中未稀释过洗手液气味条件下和纯水条件下的比较(mean ± 95% CIs)。星代表的是事后检验时和基线水平以及纯水条件相比的结果(P< 0.001)。(B) 每一种刺激物和基线相比时的最大值(mean ± 95% CI). 一星代表在0.05水平上显著。pHC, 未稀释洗手液气味条件; dHC,稀释洗手液气味条件；AR,胶布清除剂条件。

疼痛行为和皮层激活之间的关系

皮尔逊相关系数分析表明NFCS分数最大值和HbO2最大值之间在所有的气味条件下的相关系数均不显著。研究者根据NFCS得分将婴儿划分为两组：得分在0-1之间被划分为无疼痛感组，得分在2-4分之间被划分为有明显疼痛感组。然后比较两组被试在未稀释过的洗手液气味条件下痛觉皮层的HbO2变化，结果发现：在所有的痛觉皮层上，具有更高NFCS得分的婴儿能够显著地正向预测HbO2的值（如图5）。除此以外，与有较低NFCS得分的婴儿相比，具有更高NFCS得分的被试在所有的痛觉皮层均有显著激活(F = 3.50, P < 0.001, post hoc test: P < 0.05)。

图5表示未稀释过的洗手液气味条件下所有痛觉皮层血氧变化和疼痛行为的相关。虚线代表的是痛感行为得分小于1的婴儿组被试的HbO2的变化值(mean of SCa-left and right and SCb-left and right)，实线代表的是所有婴儿被和疼痛得分在2-4分之间的婴儿被试HbO2的变化值，灰色区域代表的是刺激呈现时间(10S)。条形图代表的是95%置信区间。

图6表示展现的是在未稀释过的洗手液气味条件下婴儿的继发行为和皮层变化。第一幅图表示基线条件，第二幅图代表刺激呈现结束，第三幅图代表刺激呈现后阶段，第三幅图和第四幅图均代表刺激呈现后阶段。

图中的婴儿年龄为31周左右。皮层激活图用nirsLAB v201412绘制。

葡萄糖对皮层激活和疼痛反应以后的影响

对皮层激活的影响

在每个组里，洗手液刺激之前口服葡萄糖能够抑制双侧SCa的激活（如表4）。使用葡萄糖和未使用葡萄糖的婴儿被试在SCa双侧的血氧反应变化具有显著差异（F =1.2847, P = 0.045; post hoc test: P = 0.07）。

注解：箭头表示的是变异变化的方向，事后检验方法是Newman–Keuls，SCa代表的是躯体感觉皮层，TEA代表的是年龄相当的婴儿。

我们发现在三个不同的实验组中葡萄糖的作用出现了差异（如表4）。在FT组和VPT组中，葡萄糖可以抑制未稀释过洗手液气味条件下SCa的激活。使用葡萄糖和未使用葡萄糖的FT组婴儿在未稀释过的洗手液气味条件下在SCa血氧变化会出现显著的差异(F = 2.7336, P < 0.001, post hoc test: P < 0.001) (如图7B) 。足月的早产新生儿(仅在未稀释洗手液气味条件下没有出现显著的皮层激活)，在暴露于不同气味之前使用葡萄糖可以引发显著皮层激活。但是，给足月早产新生儿施加胶布清除剂气味刺激之前使用葡萄糖会抑制SCa皮层的激活反应。

糖糖对疼痛感的调节

在呈现气味刺激物之前给婴儿使用口服葡萄糖，结果发现在未稀释过的洗手液气味条件下所有的婴儿被试NFC得分显著低于其他气味条件(F =3.3, P = 0.01; post hoc test: P < 0.001；如图7C) 。在FT婴儿被试组也发现了类似的结果(F =3.8,P = 0.005; post hoc test: P < 0.001；如图7D)。但是在VPT组和足月VPT组中，葡萄糖的摄入没有显著改变未稀释气味条件下的NFCS分数，而在胶布清除剂气味条件下，摄入葡萄糖组的NFCS得分显著低于未摄入葡糖组的NFCS得分(F = 32631,P = 0.015;post hoc test: P < 0.001)。图7展示的是口服葡萄糖改变了所有组中的血氧和行为反应。口服葡萄糖导致了在至少一种气味条件下至少一个痛觉皮层的血氧反应出现显著的差异。但是，这种效应在所有的实验组中效应方向不完全一致。

图7表示的是口服葡萄糖对脑皮层血氧反应和疼痛行为的影响。图(A) 表示所有被试在未稀释的洗手液气味条件下的结果以及是否先使用葡萄糖的结果；图(B) 表示FT组先使用葡萄糖条件下的血氧反应变化；图(C)表示在未稀释洗手液气味条件下的NFCS结果以及先使用葡萄糖的结果；图(D) 表示FT组中先使用葡萄糖对NFCS的影响。灰色区域代表的是刺激时间，星代表的是事后检验的显著性水平 (P < 0.001)。

结论

该研究发现不论是足月新生儿还是早产新生儿，陌生的气味不仅刺激婴儿的嗅觉系统同时也会使得痛觉感受皮层做出反应。同时研究发现口服葡萄糖会调节婴儿的这种疼痛感，并且显著降低皮层的血氧活动强度以及由疼痛感引发的行为。当然这些反应也与婴儿的大脑发育成熟程度和产后一定的相关经历时长有密切关系。

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或翻阅历史消息。

Cortical Responses to Alien Odors in Newborns: An fNIRS Study

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