结合fMRI对猕猴面部刺激处理区域（AF）的神经元集群内部的功能特异性研究

来自美国国家心理卫生研究所的Soo Hyun Park 等人在Neuron杂志上发表了一篇文章，结合了fMRI影像与电生理信号研究了前底（AF）区域的神经元集群，基于与fMRI时间序列的功能相关模式进行聚类分析得到7个功能亚组，从而呈现了立方毫米内的单位神经元的功能多样性。

Introduction

人类和其他灵长类动物的大脑可感知特定对象，譬如视觉皮层的几个区域专门处理诸如面部，身体和场景的刺激。使用功能磁共振成像可以确定人类和猴子颞叶和前额叶中处理面部和身体刺激的区域。对猕猴处理面部刺激区域的目标电生理记录显示该区域的电生理活动聚集在功能同质性上。此外构成面部处理系统的局部皮层区域对特定面部特征的处理也有差异，如身份，表情，面部运动和视角。总结来讲，给定面部刺激处理区域内部的神经元可能专门针对一个或多个关键特征，由此将信息在多个区域中传递，可能以层次结构排列，以支持面部刺激感知的不同方面。

前人研究表明猕猴anterior fundus（AF）面部刺激处理区域中的神经元在某些条件下可以独立反应视觉刺激，该研究检查了对闪光图像和自然视频的响应，侧重于分析大脑对自然和动态刺激的处理。在实验中通过慢性微丝束对相距数百微米之间的神经元进行采样，并记录了同一个神经元在数周内的反应。结果显示对闪烁刺激有相似反应的神经元对自然视频的反应有明显不同。值得注意的是，单个神经元对相同视频重复播放的反应高度一致，而相邻神经元的视频驱动反应中则有差异。

本文通过结合单元神经元和fMRI的方式来研究神经元局部反应的多样性。本文假设在自然条件下，AF中的单位神经元与大脑内部的特异性处理网络的关系是不同的，因此通过体素级血液动力学反应时间序列来读取孤立的单位神经元的反应。实验采用了常见的刺激方式，即固定的一组自然环境视频，使猴子在fMRI扫描期间或在AF面部单位神经元的监测期间进行测试。通过比较fMRI反应与神经反应，为每一个单位神经元构造与其相关的fMRI脑图。这种方法可以以神经元的反应为基础找到与之功能相关的皮层和皮下区域，而不仅仅找出提供视觉特征处理的脑区。结果表明AF内部的神经元存在功能性分组，且这些神经元组与面部刺激处理区域，运动敏感区域，视网膜皮层区域以及其他视觉驱动的皮层和皮下区域的相关存在差异。这种联合相关方法不依赖于神经信号和fMRI信号的测量同步性，也可以应用于多个被试，为基于全脑响应分析局部回路功能的多样性提供了有力手段。

Methods

1.被试

两只成年恒河猴参与fMRI研究（猴M1和M2;雌性，6岁，7.1和7.0公斤）；四只成年恒河猴参与电生理研究（猴M3（雌，6岁，5.6公斤），M4（雄，8岁，8.7公斤），M5（雌，9岁，5.0公斤）和M6（雌，14岁，7.3公斤），在其AF区域植入慢性微丝电极束，通过标准fMRI组块设计进行功能定位。

2.视觉刺激演示

使用了三个5分钟的视频，内容为猕猴的一系列自然行为，以及与其他猕猴和人类接触。在fMRI和电生理研究过程中，猴子直立坐在特别设计的椅子上头部被固定然后观看视频。

3.实验设计

fMRI

采用MR兼容的红外摄像机通过跟踪系统（SensoMotoric Instruments GmbH，Teltow，Germany）以200Hz的采样速率记录眼睛的水平和垂直位置。在实验的每个session开始之前，通过500ms白点固定任务校准眼睛信号，如果眼睛在电影框架内，则每2秒会收到一滴果汁作为奖励。被试M1和M2分别观看了三部电影28-36和29-40次。大多数（> 80％）的电影演示中，它们的眼睛运动都在屏幕之内。此外通过一个独立的session来定位脸部刺激处理区域，视频共有8个48秒的block，每一个block中展示12张图片，被试可自由扫描图像，如果眼睛在电影框架内，则每2秒会收到一滴果汁作为奖励。

电生理研究

使用红外视频跟踪系统（EyeLink; SR Research）记录眼睛的水平和垂直位置。在每个session开始和间隔期间根据需要校准眼睛位置。一只猴子（M3）在观影期间不进行奖励操作，而另外三只（M4，M5和M6）则有奖励，用于指导电影，定义为10.5的大“固定窗”。M3，M4，M5和M6分别观看三个电影共3-11,11-15,8和11次。QUANTIFICATION AND STATISTICALANALYSIS

4.预处理

fMRI

对于实验数据，使用AFNI / SUMA软件包（Cox，1996）和MATLAB进行预处理：原始图像转换为AFNI数据文件格式；使用AFNI函数3dTshift，使用五次（5阶）拉格朗日多项式插值的选项，将切片定时校正为在z +方向上交替；使用AFNI函数3dvolreg头动校正；然后使用PLACE算法对静态磁场不均匀性进行校正（Xiang和Ye，2007）；配准到标准模板，允许在多个测试日期间组合数据；在数据组合之前，去均值后除以平均值，将每个5分钟的扫描转换成百分比信号。

对于面部定位session数据，计算所有面部定位的响应对比度（t值），生成功能相关然后选择阈值t = 5以上的所有体素（前额叶t = 2）面部刺激ROI，然后被投影到统一表面，并绘制每个面部ROI的边界（图2和图5）。

电生理信号

使用二阶巴特沃斯滤波器和MATLAB函数过滤器，从同一宽带信号离线提取单个峰值和LFP，频带滤波在300和5000 Hz之间。使用OfflineSorter软件包（Plexon）或Wave_clus spike-sorting包对峰值点进行排序。对于四个电生理猴中的三个，LFP信号被过滤到四个非重叠频带：4-12,12-25,40-60和60-150Hz。然后通过整理每个频带限制的单试验响应来创建带限功率（BLP）信号。在确定不同线路上记录的低频信号大部分是冗余的（中值交叉通道相关系数r = 0.97）后，以单通道的走线作为代表LFP。

5.单位神经元的功能相关图

对AF中的每个单位神经元通过来自两种方法（fMRI和电生理记录）的视频驱动信号的相关来计算全脑功能图，其中每个体素的值是其fMRI时间序列与AF单位神经元之间的相关系数（图1C）。首先需要以下几个预处理：

对于单位神经元的时间序列，首先对每个单位神经元的响应进行下采样，通过取2.4 s的峰值总和（即fMRI采样间隔）来匹配fMRI时间分辨率；然后对下采样的时间序列进行平均化（图1A，步骤1）；其次通用血液动力学冲击响应函数（伽马概率密度函数）卷积到平均值，即归一化（即以平均值为中心）时间序列，以匹配MION响应的血流动力学延迟（图1A，步骤2）；最后将三个不同电影的卷积神经元时间序列连接起来，从而得到每个单位神经元15分钟的时间序列。

对于fMRI响应，首先对每个视频的所有试验的时间序列进行平均（图1B，步骤1）；使用MATLAB中的detrend.m函数去除平均时间序列中可能的线性趋势；排除了每部电影的前七个TR（16.8秒），以消除与每个视频的初始呈现相关联的血液动力学起始响应；然后三断时间序列连接起来，从而得到全脑中每个体素15分钟的时间序列（即375个volumes）（图1B，步骤2）。准备时间序列之后，对每个单位神经元，计算其与全脑所有体素的fMRI时间序列之间的Spearman相关系数（图1C）。

关于被试的再现性研究，通过 split-half 分析已评估单位神经元的相关重复性，计算两个映射之间的Spearman相关性，即相关性的两个向量（n = 15,495）。神经元的中位数相关性（n = 135）为0.93。

除了图2A和2B和图S1所示的映射之外，制作mask来排除不能一致地响应视频内容的体素。排除标准是基于许多试验中平均的fMRI信号的绝对值。具体来说，对于每个体素，我们采用了28-40次试验中15分钟时间序列的绝对值（图1B），然后计算出绝对值随时间的平均值。对视频响应幅度的分布高度偏向尾部，从0.3％到3.6％，中位数为1.09％（图S2A）。将中位数作为定义符合视频体素的最小阈值。然后对电影驱动的响应幅度图（在MATLAB中使用smooth3.m函数）应用高斯平滑，并选择进一步分析幅度大于1.09％的体素（图S2B）。在随后的分析中，将该mask应用于全脑相关图。

图1.A B

6.相关系数的显着性检验

为了去除每个体素与和每个单位神经元非刺激相关的噪声之间的相关性，使用bootstrap方法（MathWorks File Exchange提供的stableBB.m函数）来计算每个相关系数的95％置信区间，重复1000次以获得每个体素的1,000个相关系数的分布，平均后所得间隔的低高边界分别为0.1904和0.1890。

7.单位神经元功能亚组定位

根据与其他大脑区域的相关性模式开定位神经元的功能亚组，在神经元和体素之间的相关系数矩阵中应用了k均值聚类算法（MATLAB的统计工具箱中的kmeans.m函数，平方欧几里德距离度量）。筛选出与至少六个神经元相关系数绝对值大于0.3的体素点，共筛出5,581个体素，然后对四个电生理研究的猴子按神经元（n = 135）聚类。

由于K均值聚类不是一个确定性的算法，K值依次选取2到15并且对于每个K重复聚类过程，计算了聚类解释的方差百分比（即，cluster之间的平方和相对于总的平方和）（图3B中的细线）。随K值增加呈渐近趋势但没有明确凹点。当增加簇数量（即图3B中的曲线的一阶导数）时聚类解释的差异或增加显示K = 7到K = 8在大多数重复过程中没有没有增加。通过100次重复，计算了每个单元神经元聚类的稳定性（图3C）。这种概率测量方法进一步提供了确定聚类数量的有用信息：聚类的稳定性随K变化很大（图S4A）。基于1）K递增结果（图3B）和2）聚类的稳定性（图3C）得到解释方差的增益，最终确定了7个clusters。在确定簇的数量之后，如果神经元在50％的次数内没有被聚集到任何簇中，则该神经元被排除在随后的分析中。根据这个标准排除了6个神经元（图3C，箭头）。

为了验证K-means的聚类结果，使用主成分分析方法计算神经元和体素间的相关矩阵（135*5581）（MATLAB Statistics Toolbox的pca.m函数）。前四个主部分分别解释了总脑差异的3％以上（79.7％，6.8％，5.3％和3.3％，图S6），总和95％。然后绘制了每个神经元在前两个主成分中的得分（图3D）。注意，上面排除的六个神经元没有绘制在图3D中。

此外还对fMRI相关图以外的信号评估了聚类结果：将相同的K-means算法应用于四种不同类型信号的矩阵（图S4B）：（1）以相对高的时间分辨率（10Hz）计算的神经元时间序列，通过取100 ms中的峰值的总和计算；（2）1）所得时间序列的归一化结果（z-score）；（3）fMRI采样分辨率下的非归一化的神经元时间序列，通过取2.4 s中的峰值的总和计算；（4）通过将通用血液动力学函数与3）所得时间序列相结合，计算出反映血流动力学延迟的fMRI抽样分辨率的神经元时间序列。请注意，第四个时间序列用于创建全脑相关图。我们还在改变K值时重复了这四个值中的每一个的K均值聚类，并且把K = 7时的结果显示在图S4B中。

图3

8.其他时间序列的功能图

除了每个单位神经元对应的全脑图之外，还计算了其他三种类型的功能图像。第一种类型是LFP信号（图6A）创建功能图：首先将宽带LFP信号划分为四个不同的频带，并计算每个频带的BLP信号（参见预处理：电生理学）。然后计算每个原始BLP信号的z分数，并将BLP信号的时间分辨率与fMRI信号相匹配，就像每个加标时间序列一样通过对于每个TR持续时间（即2.4s）平均BLP。最后计算出每个频率的BLP和fMRI信号之间的体素级相关。

第二种类型是以功能任务的动物（M1和M2）的AF面部块中随机选择的体素点作为种子，生成AF种子点体素相关图（图6B）：经过初步预处理，其中包括对三个电影进行平均测试和结合时间序列，计算了种子点时间序列与全脑所有体素时间序列的相关。此外无论选择AF内其他体素点还是来自AF内平均时间序列，相关结果图保持不变。

第三种类型是平均神经元响应图（图6C）：在初步预处理后，对四只猴子（M3，M4，M5和M6）（n = 129）所有神经元的时间序列进行平均，然后计算平均神经元时间序列与全脑所有体素时间序列的相关。

图6

Results

1.单元神经元基于视频刺激的fMRI功能相关

图1C中的矢状视图展示了一个神经元（单元格T082a）的示例结果：其与颞上沟（superior temporal sulcus，STS）和弓状沟（arcuate sulcus）的大部分体素的激活呈现显著正相关。通过这种方法可以发现视频诱发的单元神经元的局部峰值点与大脑其他区域的功能网络内的激活之间的关系。此外为了评估每个单元神经元功能相关的重复性，将给定神经元的实验结果等分（试验次数>3），相关结果的相关系数为0.93，表明从单个单元导出的功能图在神经元内部可以高度重现。

图1.C

2.AF中邻近神经元产生多样的功能图

根据AF内单元神经元的局部激活，一种功能相关模式可能是AF中心相关性最高，然后随距离向外递减；另一种可能性是相关性限制在面部刺激相关的脑区，因为这些区域在结构上可能相连。从这些假设出发，研究由功能定位的单元神经元是否会产生相似的功能相关图。

结果表明AF内单元神经元是高度异质的，且与大脑中特别是大脑皮层的fMRI信号的相关模式是不同的。图2展示了这种多样性的两个单元神经元代表：cell T078a在STS和额叶显著正相关（r = 0.5，图2A），但相邻的cell T106a与大部分视皮层和多个前额叶区域显著负相关（r = -0.43，图2B）。

在来自电生理实验的四只猴子的纵向记录的神经元集（n = 135）中，单一单位神经元的功能相关图也显示出高度多样化（图S1和S2C）。尽管多样，但没有一个神经元与fMRI的功能相关区域仅限于AF。如图2A所示，神经元集的一个子集与大多数或所有已知的面部刺激区域都是正相关，但也有大多数神经元与许多不参与面部刺激处理的皮层区域显示出或正或负的复杂相关模式。更重要的是，即使通过同一微丝同时记录的神经元之间也观察到功能相关异质性（图2C）。

原始功能图（图2A，2B和S1）显示两种一般模式。第一，无论是正相关还是负相关，相关性最强的区域仅限于已知的视觉反应的皮层区域。听觉，体感和运动皮层基本不显著（r =±0.19,95％置信区间）。第二，如图S2C所示，正相关和负相关的特定空间组合似乎在整个群体中重现，这说明AF内的神经元基于与大脑功能活动的关系可能存在功能亚群。

图2

3.AF内神经元的聚类

为了研究AF神经元的功能亚群，对135个神经元的fMRI相关图进行了无监督的聚类分析。将每个神经元的全脑相关性图折叠成线性向量,，仅使用与所有神经元中超过5%有显著相关的体素，即5581个矢量值，然后输入标准K均值聚类算法。在分析中通过K值的范围重复了这个算法，以确定稳定的神经元亚组（图3B和3C，图S4A），最终得到7个亚组（图3B）。七个亚组（图3E中的小脑）在同质性上有差异，并来自多个被试（图3D，不同符号）。

通过平均各组内神经元的功能图来计算组图（图3E中的大脑）。每个组图都有各自典型的相关模式，分别显示了在皮层区域（示出在平坦表面，图4）和皮下区域（在选定的冠状和轴向上显示，图5）的结果。相关结果主要分布在面部刺激处理区域，运动相关皮层区域，皮下区域，早期视觉区域和前额叶皮侧。

一组神经元（细胞组1，n = 21个神经元）在面部刺激处理区域显示出正相关（图4A），这可能是由于这组神经元与该区域结构相连。同组神经元间的功能相关图有差异（参见图3E中该组的较小的图），但在与面部刺激处理区域都有共同的相关模式。在所有的区域中，与STS前部的相关性最强（r = 0.32），其与早期视觉皮层特别是V1的周边区域显示较小的负相关（r = -0.12），在皮下区域中，只与内侧脉络膜显著正相关（r = 0.16）（图5）。

另一组神经元（细胞组2，n = 21个神经元）与STS大部分区域显著正相关（r = 0.41），此外还有运动相关区域（MT，MST， FST），颞叶，外侧顶内沟（LIP）和弓形窦显著（图4B），但是与早期视觉皮层和LGN的正相关性明显较弱。对于皮下结构，与上丘，枕腹，外侧杏仁核、腹侧核、屏状核、外侧小脑显著正相关（图5）。

两个细胞组在大部分视觉皮层中表现出显著且相对均匀的相关性，一组正相关（细胞组7，n = 14个神经元，图4D），另一组负相关（CellGroup5，n = 18neur，图4C）。除正负外，两组总体相关相似；主要区别是细胞组5与面部刺激处理区域不相关。两组在皮层区域，包括上丘，腹侧枕，LGN，基底外侧杏仁核和腹壳核的大部分区域都有显著相关（图5）。然而组7与屏状核的相关性最强，但组5最弱。

其余组的相关水平都不高（细胞组3,4和6）：类似细胞组7，细胞组3中的神经元与大部分视觉皮层呈正相关（图4E），但与颞叶几乎不相关。细胞组4与STS尾部，月状沟，外下枕骨，枕上丘显著负相关（图4F，图5）。细胞组6与STS区域正相关（图4G），与视皮层呈负相关，与皮下结构相关性最小（图5）。

一个意想不到的发现是多组神经元都与视觉皮层有显著相关，对相关结果进行主成分分析发现视觉皮层相关占大约80％（图S6B），对应图3D中的第一个主成分。由于这个空间分布与电影中的对比度，亮度或运动内容与以前计算的映射不匹配（Russ和Leopold，2015），目前无法解释视觉皮层广泛参与的基础。

总之对AF神经元功能亚组的分区以及由此产生的相关性图，突出了AF内神经反应的功能多样性，表明空间相邻的神经元参与了不同的大规模脑网络。这进一步表明在局部AF神经电路中可能存在功能分工，使得相邻神经元根据与其他脑区的特异关系从而具有不同的功能特性。

图3

图4

图5

4.神经元亚群的LFP和fMRI相关

四类LFP信号的fMRI相关图显示了在STS和弓形沟显著正相关，（图6A），以及上丘，腹侧枕，腹侧核，外侧杏仁核和屏状核（图S5）。尽管猴M5与外侧杏仁核和屏状核的相关性较弱，其余三只猴子（M3，M4和M5）的每一种LFP信号的相关模式是类似的（图S5）。

AF种子点相关图显示在STS和弓形沟以及在LFP有显著正相关（图6B）。将局部LFP相关图和AF种子点体素相关图与各组神经元相关图比较后，显而易见的是，七组中只有组2与该模式相似（图3E和4B，图S5），即与STS，弓形沟和皮下区域显著出最强的相关性。

平均神经元响应图的相关结果与上述两种相关模式不同（图6C），其与面部刺激处理区域内的相关性具有高度特异性。

图6

Discussion

本研究的亮点是结合fMRI影像来研究大脑皮层立方毫米的单位神经元的功能多样性。小面积皮层内的神经元集群，其内部以非常不同的方式参与到全脑活动中，这种功能多样性可以通过与大脑fMRI信号的相关模式来对神经元集群的功能亚组进行分类。本文仅对16％的神经元通过基于全脑相关性而非特征选择性对其神经功能进行分类，这种方法为局部神经元集群内部功能的多样性研究提供了一种新的观点。

本文的研究结果表明了数据驱动方法在研究局部神经电路复杂性与全脑响应之间关系的优势。可以使用更传统和更系统的测试来对类方法产生的假设进行测试，并对刺激特征进行精确控制，比如单一单位神经元的纵向记录以研究个体神经元。这些方法的组合应用对于理解功能特异性的本质及其在高级功能中的作用非常有效。

参考文献：Park S H, Russ B E, McMahon D B T, et al.Functional Subpopulations of Neurons in a Macaque Face Patch Revealed bySingle-Unit fMRI Mapping[J]. Neuron, 2017.