文献翻译Complex integrated analysis of lncRNAs-miRNAs-mRNAs in oral squamous cell carcinoma(2)材料和方法

材料和方法

获取微阵列数据和选择数据集头颈部鳞状细胞癌的基因表达数据

（HNSCC）从Cancer Genome Atlas下载（TCGA）数据库（https://gdc-portal.nci.nih.gov/）。根据口腔的解剖学定义，387个口腔样本（336个OSCC样品和51个正常对照样品） 从587个HNSCC数据中提取。 mRNA和miRNA表达数据包括327个OSCC样本和31个非癌样本已下载。原始lncRNAs和mRNAs 数据（HUGO基因命名委员会（HGNC）数据库 （http://www.genenames.org/）包含2775个lncRNA和19004他们的靶mRNA。

从Gene获得OSCC的基因表达谱（GEO）数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov / geo /）通过研究术语“口腔鳞状细胞癌”（2016年8月）。原始数据和探针注释文件GSE9844（31个OSCC样本和24个非癌对照样本）和GSE 13601（26个OSCC样品和12个非癌症控制样品）基于Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array（Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA，USA）下载了探针进一步分析。

微阵列数据的预处理

CEL格式的原始数据和文件是预先通过背景校正处理，四分位数据标准化使用寡核苷酸（oligo）包进行总结和总结（http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/oligo.html）简而言之，原始数据被转化为可识别的表达数据。背景用标准添加方法进行校正（MSA）和lncRNA，miRNA和mRNA的表达量使用分位数方法归一化。最后，基因表达数据根据基因探针和symbol以及表达密度分布图。

鉴定OSCC中的DEG，DE-lncRNA和DE-miRNA

标准化后，对微阵列进行显着性分析（差异表达分析）采用（SAM）。edgeR包用于筛选DEGs，DE-lncRNAs和DE-miRNAs在OSCC和健康组织之间差异表达。 P值通过t检验计算值（显着性水平：p <0.05）和使用错误发现率（FDR）（<0.05）和|FC| > 1.5。之后使用Cluster软件进行有层次的分层聚类ware（3.0版，Eisen Lab，Stanford，CA，USA），使用Pearson's相关距离度量和平均链接。热图是在Cluster bb3.0和TreeView 1.60程序中生成。

与临床特征相关的DEG，DE-lncRNA和DE-miRNA

收集各种临床信息和OSCC样品根据某些临床特征分为两组（见表S1a-c）。 R的封装edgeR用于筛选出来与临床特征相关的DEG，DE-lncRNA和DE-miRNA通过设置FDR <0.05和| fold change |> 1.5作为截止点。

DEG，DE-lncRNA和DE-miRNA与预后相关

筛选无病生存（DFS）相关基因组数据，使用函数survfit进行单变量cox分析包存活调查可能的预后DEGs，DE-lncRNAs和DE-miRNAs用于无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）。采用Kaplan-Meier方法检测DE-lncRNAs的预后价值，并统计学意义使用对数秩检验评估。进行所有分析在R 3.0.1框架上。筛选OS的独立预后因素进行多变量Cox回归分析以进行筛选预后DE-RNAs和临床病理特征是OSCC患者OS的独立预后标志物。

构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络和筛选关键基因

从三个数据库BioGRID中检索的PPI对（http://thebiogrid.org/），HPRD（http://www.hprd.org/）和DIP（http://dip.doe-mbi.ucla.edu/），被整合来构建一个背景网络。 DEGs映射到PPI网络 - 工作，相互作用，信心分数超过0.4保留。之后，PPI利用Cytoscape软件可视化网络。连通度和中介性中心性分析了每个节点的（BC）。连接最多的节点（> 6个连接）被认为是中枢蛋白质。 BC 价值计算如下：使用BC值确定按BC值排名的前100。关键基因的组合 通过选择优化筛选出来。支持向量建立机器（SVM）分类模型来预测DEGs的预后效应。确认稳健性和转移 - 构建的SVM模型，GSE9884数据和GSE13601的能力数据用作验证集。模型的功效是评估 - 敏感性，特异性，阳性预测值，阴性预测值和ROC曲线下面积（AUC），使用时间依赖的接收器 - 操作员特征（ROC）曲线分析。

构建ceRNAs监管网络

DE-lncRNA和DE-miRNA对以及DE-通过计算Pearson的相关性来鉴定miRNA和DEGs 系数（PPCs）基于它们的表达水平。只有具有|coefficient|> 0.95的对被认为是共表达的。 获得了lncRNAs-miRNAs-mRNAs调节网络基于lncRNAs-miRNA和miRNA-mRNAs调节对。 DE-lncRNA与DE-miRNA之间的调节关系通过miRcode（http://www.mircode.org）预测对 starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）。监管关系通过miRTar-预测DE-miRNA和DEGs对之间的关​​系Base（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）。监管对DE-miRNAs和DEGs以及DE-lncRNAs和DE-miRNAs有相反的表达趋势，彼此被选中建立监管网络。因此，DEGs和DE-lncRNAs 由相同的DE-miRNA调节被过滤掉。综合可视化lncRNA-miRNA-mRNA的共表达网络通过Cytoscape软件。此外，预后DEGs，DE-鉴定了ceRNA网络中的lncRNA和DE-miRNA，并且 这些代表性miRNA和Kaplan-Meier的存活图绘制mRNA。

功能丰富分析

用于注释，可视化和集成发现的数据库（DAVID，http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）用于功能性 浓缩分析。 GO富集和KEGG途径使用Fisher精确检验进行如下：全基因组中的基因总数; M：基因数量; K：特征基因的数量;费舍尔的得分：至少x个基因属于功能途径基因K显着表达基因。Fisher的精确测试用于对GO类别进行分类，并且计算FDR以校正p值（显着性）水平<0.05）。

鉴定转录因子（TF）-miRNAs-lncRNAs网络

TF-miRNA调节对从TRRD获得和JASPAR数据库并映射到整个ceRNA的共表达网络。 TF-miRNAs-lncRNAs调节环通过结合TF-miRNA和miRNAs-lncRANs调控对，然后构建TF-miRNAs-lncRNAs网络