专栏首页生信技能树RNA-seq的counts值,RPM, RPKM, FPKM, TPM 的异同

RNA-seq的counts值,RPM, RPKM, FPKM, TPM 的异同

昨天阅读量破万的注释:RNA-seq这十年(3万字长文综述)

提到了RPKM值被淘汰,很多粉丝留言表示不能理解,这里解释一下不同值的异同点。 现在常用的基因定量方法包括:RPM, RPKM, FPKM, TPM。这些表达量的主要区别是:通过不同的标准化方法为转录本丰度提供一个数值表示,以便于后续差异分析。

标准化的主要目的是去除测序数据的技术偏差:测序深度和基因长度。

测序深度:同一条件下,测序深度越深,基因表达的read读数越多。

基因长度:同一条件下,不同的基因长度产生不对等的read读数,基因越长,该基因的read读数越高。

Counts值

对给定的基因组参考区域,计算比对上的read数,又称为raw count(RC)。

计数结果的差异的影响因素:落在参考区域上下限的read是否需要被统计,按照什么样的标准进行统计。

RPM (Reads per million mapped reads)

RPM方法:10^6标准化了测序深度的影响,但没有考虑转录本的长度的影响。

RPM适合于产生的read读数不受基因长度影响的测序方法,比如miRNA-seq测序,miRNA的长度一般在20-24个碱基之间。

RPKM/FPKM (Reads/Fragments per kilo base per million mapped reads)

RPKM/FPKM方法:10^3标准化了基因长度的影响,10^6标准化了测序深度的影响。

FPKM方法与RPKM类似,主要针对双末端RNA-seq实验的转录本定量。在双末端RNA-seq实验中,有左右两个对应的read来自相同的DNA片段。在进行双末端read进行比对时,来自同一DNA片段的高质量的一对或单个read可以定位到参考序列上。为避免混淆或多次计数,统计一对或单个read比对上的参考序列片段(Fragment),来计算FPKM,计算方法同RPKM。

RPKM/FPKM与RPM的区别:考虑了基因长度对read读数的影响。

RPKM与FPKM的区别:RPKM值适用于单末端RNA-seq实验数据,FPKM适用于双末端RNA-seq测序数据。

RPKM/FPKM适用于基因长度波动较大的测序方法,如lncRNA-seq测序,lncRNA的长度在200-100000碱基不等。

TPM (Transcript per million)

TPM的计算方法也同RPKM/FPKM类似,首先使用式2计算每个基因的表达值,去除基因长度的影响。随后计算每个基因的表达量的百分比,最后再乘以10^6,TPM可以看作是RPKM/FPKM值的百分比。

(http://www.bio-info-trainee.com/2017.html)

相当于重新标准化的文库,保证每个样本中所有TPM的总和是相同的。

TPM与RPKM/FPKM的区别:从计算公式来说,唯一的不同是计算操作的顺序,TPM是先去除了基因长度的影响,而RPKM/FPKM是先去除测序深度的影响,具体可看这篇博文,有计算步骤的详细说明;TPM实际上改进了RPKM/FPKM方法在跨样品间定量的不准确性。

TPM的使用范围与RPKM/FPKM相同。

总结

raw count作为原始的read计数矩阵是一个绝对值,而绝对值的特点是规模不同(基因长度、测序深度),不可以比较。进行这些基因标准化方法的目的是将count矩阵转变为相对值,去除技术偏差的影响,使后续的差异分析具有统计学的意义。

参考资料

A comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis

https://www.biostars.org/p/273537/

What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units

http://www.rna-seqblog.com/rpkm-fpkm-and-tpm-clearly-explained/

本文分享自微信公众号 - 生信技能树(biotrainee),作者:Arjuna

原文出处及转载信息见文内详细说明,如有侵权,请联系 yunjia_community@tencent.com 删除。

原始发表时间:2019-08-07

本文参与腾讯云自媒体分享计划,欢迎正在阅读的你也加入,一起分享。

我来说两句

0 条评论
登录 后参与评论

相关文章

  • 各种NGS组学数据分析异同点视频讲解

    全外显子(Whole-exome sequencing)测序是啥?转录组(RNA-seq)测序是啥?ChIP-seq又是啥?它们之间有什么差别么?傻傻分不清,不...

    生信技能树
  • WGS,WES,RNA-seq组与ChIP-seq之间的异同

    全外显子(Whole-exome sequencing)测序是啥?转录组(RNA-seq)测序是啥?ChIP-seq又是啥?它们之间有什么差别么?傻傻分不清,不...

    生信技能树
  • 【直播】我的基因组52:X和Y染色体的同源区域探索

    很久以前,我其实就遇到过通过NGS测序数据来判定性别的难题(搜索我博客即可查看详情),本次探究自己的基因组得到的统计结果与常识不符,所以我可以肯定是我们的常识太...

    生信技能树
  • 【IoT应用创新大赛】"Hello-IoT 创意桌面摆件"

    大家好,很高兴能够参与这次腾讯云IoT应用创新大赛,非常希望能够在这次比赛中得到收获与提升,同时也希望能够通过这次比赛能与各位交流学习。为了能有更多的人能够参与...

    NULL、
  • 经典Bug永流传---每周一“虫”(五)

    生命是一条湍急的河流,在短暂的流失中我们曾遇到大坝,遇到过泥沙,亦或者暴风骤雨,这些障碍与困难、磨砺与痛楚或许会成为我们心中的暗礁。可是,当我们勇敢地面对时就会...

    厦门-安仔
  • 数据告诉你,有多少网友支持南方供暖

    大数据文摘
  • Docker Swarm集群部署lnmp+redis

    我们先说一下docker集群之一的swarm集群, 先说一下集群这个东西, 它并不适用于任何项目, 他是为了解决架构中高性能的。将单节点的负载转移到多节点身上,...

    憧憬博客
  • 2020值得关注的技术 | Nature Technology Feature

    本文为Nature在今年年初的时候通过大数据分析、整理多位业内大佬采访稿所发布的报告,具有一定前瞻性,值得一读。

    生信菜鸟团
  • Linux 命令(114)—— nl 命令

    nl(number line)命令用于计算文件的行号并将带有行号的内容输出到标准输出。相比于命令 cat -n,nl 可以对行号做比较多的显示设计,包括位数与是...

    Dabelv
  • JMeter 参数化之利用JDBCConnectionConfiguration从数据库读取数据并关联变量

    http://dev.mysql.com/downloads/connector/j/

    授客

扫码关注云+社区

领取腾讯云代金券