医学生物信息学文献第7期-与侵袭性甲状腺癌进展相关的基因组和转录组特征综合分析

甲状腺癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%,包括乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌四种病理类型。未分化甲状腺癌是来源于甲状腺滤泡上皮的未分化肿瘤，与分化型甲状腺癌明显不同，未分化癌极具侵袭性，疾病特异性死亡率接近100%。诊断后，未分化患者的中位生存期约为3-5个月。晚期分化型甲状腺癌，如果发生转移等，预后效果也很差。目前还没有很好的办法来延长这类患者的生存期。随着分子生物和医学的不断发展，精准医疗已在部分癌种中取得了不错的效果。如果能在甲状腺癌中结合这些技术。导找合适的靶向药物或者免疫药物。可能会是解决目前困境的一个机会。前期尽管有一些对分化型甲状腺癌的分子特性进行了分析。但分化型甲状腺癌如何转化成晚期分化型甲状腺癌的潜在机制尚未完全阐明。有一些研究表明，肿瘤抑癌基因或原癌基因的多个突变位点与未分化甲状腺癌的发展相关，但这些研究仅局限于基因组层面的变异。对未分化甲状腺癌和晚期分化型甲状腺癌的转录组层面的信息相对较少。为发现甲状腺癌的发生发展机制以及药物靶点，转录组学分析非常有必要。

这篇文章通过多种测序技术相结合，旨在分析未分化甲状腺癌和晚期分化型甲状腺癌的基因组和转录组变异景观图谱，为晚期甲状腺癌患者的治疗提供参考。

方法：釆用大规模平行测序法对113例晚期甲状腺切除术患者新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行分析，通过全基因组测序、外显子组测序、目标区域测序等技术对这些样本进行测序分析。

观察指标：突变、基因融合、甲基化模式。

主要结局：转录组和基因组变异景观图谱。

统计方法：釆用SPSS23.0版进行统计学比较分析，釆用Kaplan-Meier法绘制疾病特异性生存曲线。

根据组织学特点分析息者的临床病理特征

患者分为5组，分别是ATC、PDTC、FocalATC/PDTC、wiFTC和转移性PTC。特征分为新鲜冰冻组织样本个数、FFPE样本个数、患者诊断和手术白勺年龄、肿瘤的起源人数是PTC、FTC还是未知的人数、远端转移人数、最终疾病状态（NED个数，AWD个数，DOD个数）、疾病特异性生存率（月）。以ATC为例做介绍。本组共纳入27个ATC样本。其中新鲜的冰冻组织样本14个，FFPE样本13个。最初诊断的年龄是60.2±15.3（平均数±标准差）。手术年龄64.7±12.4。男性10个（37%）。肿瘤起源方面，PTC有16个样本（59.3%）、FTC有8个（29.6%），未知的3个（11.1%）。远端转移的样本数20（74.1%）。最终疾病状态中NED是3个（11.1%），AWD是4个（14.8%）,DOD是20个（74.1%）。疾病特异性生存率是6.9（2.4-13.2）（中位数和四分位距）个月。注：ATC:未分化甲状腺癌：PDTC:低分化甲状腺癌:wiFTC:广泛浸润性滤泡癌：PTC:乳头状甲状腺癌：FTC:滤泡性甲状腺癌：NED:没有疾病迹象：EEPE:福尔马林固定石蜡包埋：AWD:带病生存：DOD:因病死亡。

ATC和晚期DTCs的突变景观图谱

每一列代表一个样本，只有携带被证实至少在一个肿瘤中是体细胞突变的基因被展示出来。根据基因的功能进行分类：原癌基因、抑癌基因、可变剪切机制相关基因、RET融合和端粒延长基因。右边的条形图代表了113例晚期TCs患者的基因变异频率。FU、LN、NA、PT、LRT、DMT分別表示随访、淋巴结、不可用、原发肿瘤、局部复发或残留肿瘤、远处转移肿瘤。小方块的颜色中深蓝色代表错义突变、浅绿色代表移码突变、红色代表无义突变、黄色代表剪切、紫色代表重排、天蓝色代表缺失、粉色代表生殖突变、深绿色代表C228T、蓝色代表C250T、深红色代表C228T/C250T。以ATC为例进行介绍，可以看到ATC组第一个样本为例介绍。ATC组一共27个样本，其中第一个样本使用的是全基因组测序技术，性別是男性，已经死亡，有远端转移，无淋巴结转移、测序的组织是原位癌组织、癌症类型是乳头状甲状腺癌。他的BRAF和AKT1两个基因有错义突变，TERT基因携带C228T突变。总体分析可以发现。BRAFV600E和RAS被认为是ATC的主要驱动基因，没有发现融合基因。

ATC和晚期DTCs崽者中复发突变的基因

用雷达图表示不同类型丁C复发基因的变异频率。a图代表白勺是TERT基因:b图代表TSEs基因:c图代表丁P53基因：d图代表蓝色表示不同类型的TC中AKT1/PIK3CA和EIF1AX与BRAFV600E（DE或者RAS共突变的频率。橙色表示没有BRAFV600E和RAS的突变频率。以a图为例做介绍，可以看出TERT是ATC中最常见的共突变基因，在wiFTC患者中TERT的突变频率最高，介于0.8-1之间，最低的是FA/miFTC，不到0.1，TERT突变频率第二高的是ATC，接近0.6。图b说明，大部分ATC携带肿瘤抑制基因突变如TP53、CDKN2A、PTEN、LATS1、LATS2、CTNNA2、TET1和BRCA1。图c所示。TP53是最常见的TSG改变。图d表示，在ATC中还发现AKT1/PIK3CA和EIF1AX共突变。图e表示的是在113例TC患者中复发相关原癌基因的突变分布情况。可以看到主要是无义突变和可变剪切两种类型，其中大部分都是BRAF基因的无义突变。可变剪切主要在EIF1AX基因上。图f表示的PDE8B-TERT融合的功能区域。可以看出在PDE8B白勺265位和TERT的525位发生融合，前者保留的是左边部分，后者保留的是右边部分。图g表示白勺PDE8B-TERT磊虫合TER丁在各外显子的表达水平，在突变点之后，发现了升高的TERT表达，这是融合基因的一个标志。图h表示的是不同变异类型中TERT表达水平，使用DESeq2的p值。结果显示，携带PDE8B-TERT的wiFTC坪口来自TCGA组携带MTMR12-TERT的PTC中。TERT表达显著升高。图i表示TERT上游易位示意图，在上游易位的配体区域，发现了典型的增强子和超增强子，箭头所指为断点。

DTCs息者中CDKN2A缺失

图a表示在ATC患者中使用全基因组测序检测到的CDKN2A基因缺失。图b表示在ATC患者中使用目标区域测序检测到的CDKN2A基因缺失。图c表示使用雷迖图展示不同类型的TC中CDKN2A基因缺失频率，可以看出在ATC类的患者中频率最高，超过0.2。在PTC和wiFTC患者中没有检测到。图d表示在113例TC患者中TP53和CDKN2A基因突变分布情况。深蓝色表示无义突变,绿色表示移码突变，红色是无义突变，天蓝色是缺失。粉色是生殖变异。可以看出大部分都是无义突变。其中缺失突变只发生在CDKN2A基因上。并且在10个样本中检测到。另外。TP53基因也检测到了生殖突变、移码突变和无义突变。但是这几种类型的突变样本数不多。图e表示，在ATC患者中CDKN2A缺失对P状腺分化评分的影响。蓝色表示缺失，可以看出缺失后比正常的评分显著降低。p<0.001。图f表示CDKN2A缺失对ATC和晚期DTCs患者疾病特异性生存的影响，其中2n表示正常的CDKN2A。del表示缺失。可以看到不管在哪一类患者中缺失后疾病特异性生存均下降。图g表示,pl6表迖对ATC及晚期DTCs患者疾病特异性生存的影响，可以看出pl6阴性会降低疾病特异性生存。但是在两类患者中pl6阴性与阳性没有显著差异。p值均是0.03。这里的p值是使用Log-Rank检验得出的。

ATC和晚期DTC息者的转彔组景观图谱

图a表示。通过主成分分析得到k均值聚类结果。肿瘤类型和驱动突变分別用形状和颜色表示。不同形状代表不同的疾病类型，可以看出一共5种甲状腺癌。不同颜色代表不同的基因。可以看到根据图表集中的信息明显的聚类成4组，分別是ATC类、BRAF类（主要是BRAF相关的变异）、RAS类（主要是RAS相关变异）以及NBNR类（变异类型比较多样化）。图b表示以箱型图表示brafV600E-RAS评分分析结果，p值使用曼-患特尼U检验得到。囝c表示。在散点图上显示TDS和ERK评分。Sd和e分別用箱图表示dTDS分析结果和ERK评分分析结果表示，p值使用曼-患特尼U检验得到。可以看出，无论驱动突变是什么。ATC都显示出相似的甲状腺分化（图4d）,并且在RAS阳性ATC中，MAPK信号通路的活性高于BRAFV600E阳性ATC（图4e）。图f表示。在TC患者中甲状腺功能和代谢相关的16个基因的表迖热图。右图的热图表示正常的甲状腺组织基因表迖水平。图的最上面是四种甲状腺癌类型。第二行是分子亚型。左侧是16个基因的名宇，可以看出相同分子亚型的患者各个基因的表迖水平比较一致。可以看出在wiFTC中，与甲状腺代谢功能相关的7个基因(SLC5A8、TPO、FOXE1,DI02,TG、GLIS3和SLC26A4）的表达显著降低。

ATC潜在的药物靶点

图a表示。BRAFV600E阳性和RAS阳性ATCs中显著上调的前15个KEGG通路。这些通路在PTC、FA/miFTC和wiFTC也很重要。因为它们也在每个胂瘤均在上调的前15个中。横坐标表示胂瘤的类型。纵坐标表示通路的名称。点的大小代表基因比例。越大则基因比例越高，颜色代表q值。由蓝色到红色q值从大到小。可以发现。不同的途泾。如MAPK信号通路、局灶性粘附、细胞外基质（ECM）受体相互作用、p53信号和细胞粘附分子（CAMs）,最初在PTC中相对于正常甲状腺增加。在BRAFV6QQE阳性的ATC患者中进一步激活。图b表示,与FA/miFTC/wiFTC比较，RAS阳性ATC中JAK-STAT-信号通路基因的水平增加,用Log2（fold-change）值表示。星号表示在BRAFV600E阳性ATC中也上调。可以看出，除MAPK信号通路外。这些通路在wiFTC中相对于FA/MIFTC没有激活。此外。在3种滤泡型胂瘤中未检测到的JAK-STAT信号通路在RAS阳性的ATC中被激活。图c表示，定量逆转录PCR测定JAK-STAT-信号通路基因的表迖,图d通过细胞计数kit-8试验分析了使用鲁索替尼（1、10、20和25uM）治疗CAL72细胞治疗后的细胞异常情况。图c中发现,在CAL62中。RAS阳性的ATC细胞中。用鲁索替尼抑制JAK,降低了JAK-STAT通路下游分子S0CS3、BCL2L1和MYC的表迖。图d证实细胞增殖减少。Ctrl表示对照，所有数据均以均数±标准差表示。*曼-患特尼U检验得到，P<0.05（与对照组比较）。图e表示。在不同的TC类型中。尤其是一些ATC中分別編码PD-L1和PD-L2的CD274和PDCD1LG2的表迖水平也上升。图f表示，这些基因白勺上调是在CDKN2A缺失的ATC中发现的。两个免疫治疗相关基因上调与CDKN2A缺失有关,样品按TDS从高到低的进行分类。

文章总结

优劣势：该研究优势在于选择的癌种，不是千篇一律的肺癌、肠癌等，而是从甲状腺癌入手，分子靶向药以及精准医疗在甲状腺癌种还没有得到广泛的推广。另外，使用多种技术在多个类型的甲状腺癌样本中开展大规模测序工作，共113个甲状腺癌，样本量丰富，技术手段多样化。而且使用定量PCR以及细胞学实验对测序所得结果进行了验证，这个一个不错的加分项。一般生信分析的文章如果再加上一些验证实验，发表的档次会有很大的提高。

创新性:本身甲状腺癌的分子研究相对其他癌种较少，该研究使用全基因组、外显子组以及目标区域测序进行分析，在前期二类甲状腺癌的基础上又分出第三个分子亚型，非BRAF-非-RAS（NBNR）。另外，该研究还展示了甲状腺癌的转录组图谱。为后续药物靶点的确定奠定了基础。

后续研究空间：后续研究可以从甲状腺癌的长链非編码RNA、miRNA、肠道微生物等角度入手，对甲状腺的分子基础研究进行彻底研究。从临床应用层面角度讲，目前对甲状腺的研究中液体活检技术应用相对也较少，可以尝试从导找分子标志物方向入手也是—个思路。