实时定量PCR（RT-qPCR）实验操作流程

一. RT-qPCR 基本原理和概念 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

以 cDNA 为模板进行 PCR，在 PCR 扩增过程中，通过收集荧光信号，对 PCR进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。分为：探针类和非探针类。

在实时 PCR 扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和 Ct 值。

基线（baseline）：一般来讲，第 3-15 个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。

阈值（threshold）：阈值一般是基线的标准偏差的 10 倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。

Ct 值（Ct value）： Ct 值就是荧光值达到阈值时候的 PCR 循环次数。所以是一个没有单位的参数。跟初始模板的量呈反比。

二. 检测方法

SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

三. RT-qPCR具体实验步骤

引物设计：

除了遵循一般的引物设计原则外，需要注意产物长度应控制在80-150bp。片段越短扩增效率越高，但若小于75bp则无法与潜在的引物二聚体区分，从而给判断引物优劣带来障碍。如果文献中有的话可以直接用文献中的引物，也可以自己设计。引物设计软件有：Oligo6， Paper ，Primer Premier 6等。

RNA的提取：

提取RNA可用试剂盒，比如QIAGEN RNeasy Mini Kit ，按照说明书操作就行了，还可以利用TRlzol试剂提取，具体实验步骤参考：TRlzol法提取组织或细胞RNA。

关于RNA的提取，这里需要补充的是：将 RNA 反转录成 cDNA。RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量，而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。

（1）干热灭菌（180℃，60 min）

（2）用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃下处理 12 小时。然后在 120℃下高压灭菌 30分钟以除去残留的 DEPC。RNA 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于 RNA 实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用 RNA 实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用 0.1%的 DEPC 处理后进行高温高压灭菌。RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

反转录：

反转录PCR（Reverse Transcription，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有 cDNA 作为模板检出的先决条件，但 Total RNA 中常常混有基因组 DNA，并可以直接作为 PCR 反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组 DNA 得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对 Total RNA 样品进行 DNase I 处理，以除去残存的基因组 DNA。而 DNase I 处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成 RNA 的降解和损失。大连宝生物的产品PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 是可以除去基因组 DNA 进行 Real Time RT-PCR 反应的专用反转录试剂。Kit 中使用了具有较强 DNA 分解活性的 gDNA Eraser，通过 42℃，2 min 即可除去基因组 DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制 DNA 分解酶活性的组分，经过 gDNA Eraser 处理后的

样品可以直接进行 15 min 的反转录反应合成 cDNA，因此，20 min 内即可迅速完成从基因组 DNA 去除到 cDNA 合成的全过程。这个产品合成的cDNA适用于嵌合法和探针法qPCR分析。

我们实验室用的就是大连宝生物的产品：PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)。

反转录具体还可参考文章：反转录PCR

PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)

1. 去除基因组 DNA 反应

按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2 的量配制 Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入 RNA 样品。

20 μl 反转录反应体系中，TB Green qPCR 法最多可使用 1 μg 的 Total RNA，探针 qPCR

分析法 最多可使用 2 μg 的 Total RNA。

配置好反应体系后，42℃ 2 min（或者室温 5 min*2），4℃ +∞，本实验室用42℃ 2 min。

2. 反转录反应

反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2 的量配制 Master Mix，然后再分装 10 μl 到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

3.注意事项：

若不配制 Master Mix，向步骤 1 的反应液中添加试剂时，要先加入 RNase Free dH2O 和5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)混合均匀，以使 gDNA Eraser 的活性充分受到抑制， 再添加 RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I，轻轻混匀进行反转录反应。

使用 RT Primer Mix 可以高效合成 cDNA。因为实验目的不同，也可以不使用 RT Primer Mix，

而选择 Oligo dT Primer 或 Gene Specific Primer 进行反转录反应，引物使用量如下：

Oligo dT Primer 50 pmol／20 μl 反应体系

Gene Specific Primer 5 pmol／20 μl 反应体系

反转录体系可以根据需要相应扩大。

使用 Gene Specific Primer 时，建议反转录反应条件设置为 42℃ 15 min。PCR 反应有非特异性扩增时，将温度升到 50℃会有所改善。

合成的 cDNA 需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。

在反转录反应中，TB Green qPCR 法的 RT Primer Mix 用量为 1 μl， 探针 qPCR分析法的用量为 4 μl。

得到的 RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR 反应体积的 1/10（V/V）量。

Real Time PCR ：

1.反应体系的配制

本实验室用的是大连宝生物的产品：TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus), Bulk。

这个试剂盒是采用嵌合荧光检测法，TB Green 与双链 DNA 结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的 TB Green 荧光强度，达到检测 PCR 产物扩增量的目的。具体原理见下图。通过 PCR 反应生成双链 DNA，TB Green 与双链 DNA 结合发出荧光，通过检测PCR 反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的 DNA 片段的融解温度。

反应体系的配制和PCR仪还有关系，不同的PCR仪，配制PCR 反应液可能不同，具体参照试剂的说明书和按照不同仪器的操作手册提供的方法操作。

本实验室用的是 Applied Biosystems 的仪器，参考试剂盒中 Applied Biosystems 7500 and 7500 Fast Real-Time PCR System 和 StepOnePlus Real-TimePCR Systems 的操作方法。

使用 StepOnePlus Real-Time PCR System 时，ROX Reference Dye (50X)添加量为 PCR 反应体系的 1/50。考虑到吸取误差，配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的 10%。按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。

其他公司的产品可能会有所不同，下面是Biosxience公司的试剂盒体系配制表。

2. 进行 Real Time PCR 反应

建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序。由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩增反应。

Holding Stage

Step 1: 95℃ 30 sec

Cycling Stage

Number of Cycles: 40

Step 1: 95℃ 3 sec

Step 2: 60℃ 30 sec

Melt Curve Stage

3. PCR结果

反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。

四. 数据分析

相对定量：检测实验组和对照组中一个靶基因的倍数差异。

 如果对RNA模板的数量不能精确定量，或者只需要知道目的基因的表达差异时，可以使用相对定量法。

 需要进行归一化处理

绝对定量：是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。

检测给定数量的样品中靶基因mRNA拷贝数。

 如果想知道每毫升样品中的某基因的拷贝数时，使用绝对定量。

 需要校准。

相对定量计算方法

常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法， ΔCt法， 2-ΔΔCt法(Livak法)，用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。

更多的数据处理方法，看文末，获取资料，里面有个文件：

但实际上，我们一般采用上表计算就可以了。

五. Real-Time qPCR常见问题分析

1.无Ct值出现

 检测荧光信号的步骤有误: 一般SybrGreen法采用72℃延伸时采集， Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。

 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2. Ct值出现过晚（Ct>38）

 扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

 PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

3. 标准曲线线性关系不佳

 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。

 模板中存在抑制物，或模板浓度过高

4. 负对照有信号

 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。

 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

5. 溶解曲线不止一个主峰

 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。

 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

6. 扩增效率低

 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？

 判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性

 如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。

8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？

 参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)

 模板的浓度太高或者降解

 荧光染料的降解