单细胞预测Doublets软件包汇总|过渡态细胞是真的吗?

写在前面

Doublets:一个液滴或一个微孔中包含了2个或多个细胞 。

对于高通量方法,在细胞捕获效率和doublets比例之间存在折中,通常的做法是以1-5%的doublets为目标(Ziegenhain et al., 2017)(http://refhub.elsevier.com/S0098-2997(17)30049-3/sref115) 。

以前在分析单细胞数据的时候,我其实从来没有注意过这样一个问题,即使知道可能会出现doublet,还是会天真地认为自己的专业知识是可以把这一部分避免掉,比如当同时在一类细胞中发现两种不同的细胞Marker(他们之间不可以相互转化),我一般会果断的定义为污染。可是随着看的文献越来越多,发现细胞之间的特异性marker越来越模糊,一些不能进行相互转化的细胞marker可能存在于某一小类细胞中。

当然,这些R包并不一定能够解决这些问题,多数的Doublet软件对异质性较高的细胞之间的预测较好,但希望通过总结这类软件,提醒大家在定义过渡态细胞时一定要反复去验证,保证数据的真实性。

Doublet软件包汇总

1.DoubletFinder

DoubletFinder是一种R包,可预测单细胞RNA测序数据中的doublet。

实现DoubletFinder:Seurat> = 2.0(https://satijalab.org/seurat/)

DoubletFinder由Cell Systems于2019年4月出版:https://www.cell.com/cell-systems/fulltext/S2405-4712(19)30073-0

安装(在R/RStudio中)

devtools::install_github('chris-mcginnis-ucsf/DoubletFinder')

依赖包

  • Seurat (>= 2.0)
  • Matrix (1.2.14)
  • fields (9.6)
  • KernSmooth (2.23-15)
  • modes (0.7.0)
  • ROCR (1.0-7)

DoubletFinder概述

DoubletFinder可以分为4个步骤: (1)从现有的scRNA-seq数据中生成artificial doublets;

(2)预处理合并的real-artifical data;

(3)执行PCA并使用PC距离矩阵查找每个单元的artificial k 最近邻居(pANN)的比例; (4)根据预期的doublets数量排序和计算阈值pANN值;

缺点:DoubletFinder对同种类型细胞间的doublets不敏感 - 即从转录相似的细胞状态衍生的doublets。

Example

## Pre-process Seurat object -------------------------------------------------------------------------------------------------
seu_kidney <- CreateSeuratObject(kidney.data)
seu_kidney <- NormalizeData(seu_kidney)
seu_kidney <- ScaleData(seu_kidney, vars.to.regress = "nUMI")
seu_kidney <- FindVariableGenes(seu_kidney, x.low.cutoff = 0.0125, y.cutoff = 0.25, do.plot=FALSE)
seu_kidney <- RunPCA(seu_kidney, pc.genes = seu_kidney@var.genes, pcs.print = 0)
seu_kidney <- RunTSNE(seu_kidney, dims.use = 1:10, verbose=TRUE)

## pK Identification ---------------------------------------------------------------------------------------------------------
sweep.res.list_kidney <- paramSweep(seu_kidney, PCs = 1:10)
sweep.stats_kidney <- summarizeSweep(sweep.res.list_kidney, GT = FALSE)
bcmvn_kidney <- find.pK(sweep.stats_kidney)

## Homotypic Doublet Proportion Estimate -------------------------------------------------------------------------------------
homotypic.prop <- modelHomotypic(annotations)           ## ex: annotations <- seu_kidney@meta.data$ClusteringResults
nExp_poi <- round(0.075*length(seu_kidney@cell.names))  ## Assuming 7.5% doublet formation rate - tailor for your dataset
nExp_poi.adj <- round(nExp_poi*(1-homotypic.prop))

## Run DoubletFinder with varying classification stringencies ----------------------------------------------------------------
seu_kidney <- doubletFinder(seu_kidney, PCs = 1:10, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp_poi, reuse.pANN = FALSE)
seu_kidney <- doubletFinder(seu_kidney, PCs = 1:10, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp_poi.adj, reuse.pANN = "pANN_0.25_0.09_913")

## Plot results --------------------------------------------------------------------------------------------------------------
seu_kidney@meta.data[,"DF_hi.lo"] <- seu_kidney@meta.data$DF.classifications_0.25_0.09_913
seu_kidney@meta.data$DF_hi.lo[which(seu_kidney@meta.data$DF_hi.lo == "Doublet" & seu_kidney@meta.data$DF.classifications_0.25_0.09_473 == "Singlet")] <- "Doublet_lo"
seu_kidney@meta.data$DF_hi.lo[which(seu_kidney@meta.data$DF_hi.lo == "Doublet")] <- "Doublet_hi"
TSNEPlot(seu_kidney, group.by="DF_hi.lo", plot.order=c("Doublet_hi","Doublet_lo","Singlet"), colors.use=c("black","gold","red"))

详情可以点击DoubletFinder(https://github.com/ddiez/DoubletFinder)对自己的数据进行一下预测哦!

2.scrublet

Single-Cell Remover of Doublets

用于识别单细胞RNA-seq数据中doublets的Python代码。可以参考 Cell Systems(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405471218304745) 上的文章或者 bioRxiv(https://www.biorxiv.org/content/early/2018/07/09/357368).

Quick start:

给定原始(非标准化)UMI计算矩阵counts_matrix,其中细胞为行,基因为列,计算每个cell的doublet分数:

import scrublet as scr
scrub = scr.Scrublet(counts_matrix)
doublet_scores, predicted_doublets = scrub.scrub_doublets()

scr.scrub_doublets()模拟数据的doublets,并使用k-最近邻分类器是每个转录组计算连续的doublet_score(在0和1之间)。分数是由自动设定的阈值生成 predict_doublets,一个布尔数组,预测是doublets时为True,否则为False。

Best practices:

1.处理来自多个样品的数据时,分别对每个样品运行Scrublet。Scrublet用于检测由两个细胞的随机共包封形成的doublets,所以它可能在合并数据集上表现不佳;

2.在2-D嵌入(例如,UMAP或t-SNE)中可视化doublets预测;

Installation:

To install with PyPI:

pip install scrublet

To install from source:

git clone https://github.com/AllonKleinLab/scrublet.git
cd scrublet
pip install -r requirements.txt
pip install --upgrade .

详情可以点击scrublet(https://github.com/AllonKleinLab/scrublet)对自己的数据进行一下预测哦!

3.DoubletDecon

一种细胞状态识别工具,用于从单细胞RNA-seq数据中去除doublets.

具体步骤可以参见文章:

bioRxiv(https://www.biorxiv.org/content/early/2018/07/08/364810)

安装

if(!require(devtools)){
  install.packages("devtools") # If not already installed
}
devtools::install_github('EDePasquale/DoubletDecon')

依赖包

  • DeconRNASeq
  • gplots
  • dplyr
  • MCL
  • clusterProfiler
  • mygene
  • tidyr
  • R.utils
  • foreach
  • doParallel
  • stringr
source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite(c("DeconRNASeq", "clusterProfiler", "hopach", "mygene", "tidyr", "R.utils", "foreach", "doParallel", "stringr"))
install.packages("MCL")#进行安装依赖包

Example

以下数据的应用均来自于:

bioRxiv(https://www.biorxiv.org/content/early/2018/07/08/364810)

location="/Users/xxx/xxx/" #Update as needed
expressionFile=paste0(location, "counts.txt")
genesFile=paste0(location, "Top50Genes.txt")
clustersFile=paste0(location, "Cluster.txt")

newFiles=Seurat_Pre_Process(expressionFile, genesFile, clustersFile)
filename="PBMC_example"
write.table(newFiles$newExpressionFile, paste0(location, filename, "_expression"), sep="\t")
write.table(newFiles$newFullExpressionFile, paste0(location, filename, "_fullExpression"), sep="\t")
write.table(newFiles$newGroupsFile, paste0(location, filename , "_groups"), sep="\t", col.names = F)

results=Main_Doublet_Decon(rawDataFile=newFiles$newExpressionFile,
                           groupsFile=newFiles$newGroupsFile,
                           filename=filename,
                           location=location,
                           fullDataFile=NULL,
                           removeCC=FALSE,
                           species="hsa",
                           rhop=1.1,
                           write=TRUE,
                           PMF=TRUE,
                           useFull=FALSE,
                           heatmap=FALSE,
                           centroids=TRUE,
                           num_doubs=100,
                           only50=FALSE,
                           min_uniq=4)

详情可以点击:

DoubletDecon(https://github.com/EDePasquale/DoubletDecon)对自己的数据进行一下去除doublets哦!

4.DoubletDetection

DoubletDetection是一个Python3包,用于检测单细胞RNA-seq计数矩阵中的doublets(技术错误)。

安装

git clone https://github.com/JonathanShor/DoubletDetection.git
cd DoubletDetection
pip3 install .

运行基本doublet分类:

import doubletdetection
clf = doubletdetection.BoostClassifier()
# raw_counts is a cells by genes count matrix
labels = clf.fit(raw_counts).predict()

raw_counts是scRNA-seq计数矩阵(基因细胞),并且是阵列式的 labels是一维numpy ndarray,值1表示检测到的doublet,0表示单细胞,np.nan表示模糊的细胞。

分类器在以下情况运行最适合

  • 数据中存在几种细胞类型;
  • 它在聚合计数矩阵中每次单独运行;

本文分享自微信公众号 - 生信宝典(Bio_data)

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原始发表时间:2019-09-02

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