细胞冻存实验

一、实验前准备

实验开始前，将冻存管、 15 毫升离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30 分钟。采用通风机通风 3 分钟。以 75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。将离心机调节至 800 转， 5 分钟。水浴箱调节至 37 度恒温。取细胞完全培养基、 DMSO、胰蛋白酶等，放于水浴箱中预热。首先消毒双手和超净台。取约 10 毫升细胞完全培养基放于 15 毫升离心管中。

配置细胞冻存液：冻存液应该提前配制，置于室温备用，防止临时配制产生的热量损伤细胞，按无血清培养基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置细胞冻存液，其中加大冻存液中血清的比例对于保存某些脆弱的干细胞以及一些比较珍贵的细胞很有好处的。按比例加好冻存液组分后，轻轻吸打混匀，置于室温下待用。

二、胰蛋白酶/EDTA 消化

从细胞培养箱中取出细胞， 进行瓶口消毒，弃去细胞原来的培养基。按每 25 平方厘米 1 毫升胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入两毫升细胞完全培养基以立即终止消化。采用无菌枪头轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有细胞悬液放入一干净的 15 毫升离心管内。

配平离心：采用天平配平两端， 每分钟 800 转，室温离心 5 分钟。三、细胞计数采用罗氏 CASY-DT 快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入 10 毫升 CASY-ton至以标记 viable 的管子中，加入 100 微升细胞悬液，颠倒混匀三次，可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞总数。

四、细胞冻存

取出冻存管，注明细胞名称、代数、日期。

离心后，以无菌吸管吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。将细胞沉淀与冻存液充分混匀，根据计数结果，将细胞总数调节至细胞数量为每毫升有 5 乘 10 的五次方为宜。将细胞冻存悬液分装入细胞冻存管中，一般一个两毫升冻存管装入 1 至 1.5 毫升细胞冻存悬液为宜。

严密封口后，进行程序性降温冻存：首先 4 度 30 分钟， 负 20 度 30 分钟， 负 80 度过夜，最后进行液氮保存。

另有一种比较实用的降温方法：用最少两厘米厚的医用棉纱将冻存管紧紧包裹，扎紧，直接放入-70 度冰箱，隔夜取出冻存管直接放液氮冻存。或直接采用程序性降温盒更为方便。

五、注意事项

1、细胞活力及浓度

细胞应在生长良好、致密度约为 80-90％、 数目一般为 10^6-10^7/ml， 活力达 90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

2、注意冷冻保护剂之品质

DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色， 可以用 0.22 微米滤膜过滤，或者直接购买无菌产品。以 5-10 ml 小体积分装， 4℃避光保存，勿作多次解冻。

使用 DMSO 前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保存效果。在常温下， DMSO 对人体有害，故在配制时最好带上手套。混匀 DMSO 要快，因为 DMSO 对细胞有毒性，混合后应尽快冻存。尤为值得注意的是细胞中加入冻存液后，一定要混匀，防止 DMSO 沉淀。

3、 提前配制冻存液

冻存液应该提前配制，置于室温备用，防止临时配制产生的热量损伤细胞。4、实行细胞慢冻的原则缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶，导致细胞损害。对于大多数细胞来说，每分钟降 1-3℃是合适的。相反， 若不缓慢冷冻，造成的结晶就大，大结晶会引起细胞膜、 细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶.