lncRNA芯片的探针到底该如何注释到基因组信息呢
这个，当然没有问题，就是需要时间来实现，主要是因为lncRNA芯片的探针设计的时候并不是依据基因组设计，而是mRNA和lncRNA本身序列设计的，所以探针是会跨越外显子的，这一点在官网问答也说的很清楚：
For the coding mRNA on the array, is it just the exon regions or is it the whole gene locus (introns and exons)？参考：https://www.arraystar.com/service/faq/ For each protein-coding mRNA, we designed a probe targeting their specific exon or exon-junction regions.
假如我们采取基因组比对策略，会有一个bugs出现，我给大家实例演示一下bowtie和hisat的区别，反正都是Johns Hopkins University的科研人员开发的。bowtie和hisat的软件安装，数据库参考文件，索引构建等等准备工作这里就不赘述了。
首先使用bowtie1比对全部的fasta序列探针
下面是一个例子，我首先去下载制作了 GPL15314_seq2fa.fasta 文件，然后使用bowtie1比对，参数选择的解释也在下面：
bowtie1=/trainee/jmzeng/tools/bowtie-1.1.2/bowtie
# http://bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml
# In -v mode, alignments may have no more than V mismatches, where V may be a number from 0 through 3 set using the -v option.
# -m, Suppress all alignments for a particular read or pair if more than <int> reportable alignments exist for it.
bowtie2=/trainee/jmzeng/tools/bowtie2-2.3.5.1/bowtie
fasta=/trainee/jmzeng/Probe_seqfasta/lncRNA/human/GPL15314_seq2fa.fasta
sample=GPL15314
# # GPL15314 Arraystar Human LncRNA microarray V2.0 (Agilent_033010 Probe Name version)
index=/trainee/jmzeng/genome_index/human/human
$bowtie1 -v 0 -m 1 -p 6 $index -f $fasta -S ${sample}.sam
得到的log日志是：
# reads processed: 60699
# reads with at least one reported alignment: 49162 (80.99%)
# reads that failed to align: 9043 (14.90%)
# reads with alignments suppressed due to -m: 2494 (4.11%)
Reported 49162 alignments to 1 output stream(s)
发现比对率有点低，然后我搜索了其中几个探针，去blat看看为什么比对不上，发现果然是外显子问题。我们的这个探针序列是60个碱基，使用bowtie1比对失败，就是因为它没办法把这个探针序列的60个碱基拆分成为两个部分，分开比对在参考基因组的不同区域。
然后点击进入详情，可以看到我们的这个探针序列的60个碱基被拆分成为两个部分，分开比对在参考基因组的不同区域。
image-20191201112356413
然后看看hisat
所以我们换一个比对工具，因为是需要跨越内含子的比对，所以选择hisat
hisat2=/trainee/jmzeng/tools//hisat2-2.0.0-beta/hisat2
fasta=/trainee/jmzeng/Probe_seqfasta/lncRNA/human/GPL15314_seq2fa.fasta
sample=GPL15314
index=/teach/database/index/hisat/hg38/genome
$hisat2 -f $fasta -x $index -S ${sample}.sam
然后发现
60699 reads; of these:
60699 (100.00%) were unpaired; of these:
519 (0.86%) aligned 0 times
54578 (89.92%) aligned exactly 1 time
5602 (9.23%) aligned >1 times
99.14% overall alignment rate
比对率不得了啊！
题外话
我很喜欢blat这个在线网页工具，因为当初听说它的速度甩blast工具几十条街。
在我B站视频，多次提到它的奇妙用法，但是我也是今天才知道，它居然也可以跨越内含子进行比对。
更多表达芯片的公共数据库挖掘系列更多教程，见推文 ；