使用IMPUTE2进行基因型填充

impute2是一款基因型填充软件，和其他软件相比，其填充的准确率最高，网址如下

https://mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/impute_v2.html

提供了以下两大功能

1. haplotype phasing,单倍型分析
2. genotype imputation,基因型填充

基因型填充的基本模型示意如下

需要两个基本元素，第一个是检测样本的分型结果，即图中所示的study genotypes, 第二个元素称之为reference panel, 对应图中的reference haplotypes, 利用高密度的reference panel对检验样本为覆盖到的SNP位点，或者缺失的分型结果进行填充，对应图中问号表示的位点。

该软件的安装比较简单，官网提供了编译好的可执行文件，下载解压缩即可

对应的代码如下

wget https://mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/impute_v2.3.2_x86_64_static.tgz
tar xzvf impute_v2.3.2_x86_64_static.tgz

除了软件外，还需要reference panel，官网也提供了对应的下载文件，包括hapmap和1000G两个常用的reference panel,链接如下

https://mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/impute_v2.html#download

impute2官方推荐了一套基因型填充的最佳实践，步骤如下

1. 对检测样本的原始分型结果质控，使用GWAS分析的质控条件即可
2. 校正基因组版本，hapmap和1000G都是基于hg19版本，必须保证和reference panel的基因组版本一致，才可以准确填充，如果不一致，可以使用UCSC的liftOver工具进行转换
3. 校正链的方向, hapmap和1000G的结果都是基于参考基因组的正链表示的，为了和reference panel进行匹配，必须将芯片的分型结果也统计校正到正链
4. 选择reference panel，1000G比hapmap的snp位点数量更多，密度更大，是目前最常用的reference panel, 其中又分成了不同的人群，对于某些研究，可以选择更加契合自己的人群，比如选择亚洲人群进行分析
5. 基因型填充
6. 填充后的质控，对填充后的分型结果进行过滤，同样基于GWAS的质控条件
7. 关联分析，填充后的snp位点数量更多，有助于检测阳性的信号
8. 显著关联区域的重新填充，对于GWAS筛选出来的阳性区域，可以使用更加严格的参数重新填充，再进行关联分析，确保分析的可靠性

impute2提供了以下两种用法

1. one step

填充准确率最高的方法，基本用法如下

impute2 \
-m ./Example/example.chr22.map \
-h ./Example/example.chr22.1kG.haps \
-l ./Example/example.chr22.1kG.legend \
-g ./Example/example.chr22.study.gens \
-strand_g ./Example/example.chr22.study.strand \
-int 20.4e6 20.5e6 \
-Ne 20000 \
-o ./Example/example.chr22.one.phased.impute2

基因型填充计算量非常大，所以需要先拆分染色体，对每条染色体进行填充。上述是官方自带的一个例子，对22号染色体进行填充，-m参数指定连锁图谱，-h和-l参数指定reference panel的单倍型结果，对应后缀为haps和legend，-g参数指定study样本的分型结果，格式为GEN, -strand_g参数指定snp位点的正负链信息，用于校正链的方向，-int参数指定需要填充的染色体区域，包含了起始和终止两个位置的值，对应的长须推荐小于5Mb, -Ne参数官方推荐取值为20000，-o参数指定输出的填充结果。

2. two step

增加了对study样本的pre-phasing, 运行速度更快，pre-phasing基本用法如下

impute2 \
-prephase_g \
-m ./Example/example.chr22.map \
-g ./Example/example.chr22.study.gens \
-int 20.4e6 20.5e6 \
-Ne 20000 \
-o ./Example/example.chr22.prephasing.impute2

-prephase_g参数表示对study样本进行pre-phasing, -m参数可以提高单倍型分析的准确性。

基于pre-phasing的结果进行填充的基本用法如下

./impute2 \
-use_prephased_g \
-m ./Example/example.chr22.map \
-h ./Example/example.chr22.1kG.haps \
-l ./Example/example.chr22.1kG.legend \
-known_haps_g ./Example/example.chr22.prephasing.impute2_haps \
-strand_g ./Example/example.chr22.study.strand \
-int 20.4e6 20.5e6 \
-Ne 20000 \
-o ./Example/example.chr22.one.phased.impute2
-phase

即使采用两步法，基因型填充仍然是一个运行时间很长的步骤，在实际操作中，可以同时结合染色体拆分和染色体划分窗口两种方式，再加上并行来提升运行效率。

官方提供了更多的用法示例，链接如下

https://mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/impute_v2.html#examples

更多细节参数请参考官方文档。