scRNA-seq数据处理—Kallisto
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希望大家能有所收获！
目录
⊙引言—关于课程
⊙scRNA-seq简介
⊙scRNA-seq原始数据的质控
⊙scRNA-seq数据处理—文件格式小结
⊙scRNA-seq数据处理—demultiplexing
⊙scRNA-seq数据的处理—STAR
正文
处理原始scRNA-seq数据
3.6
Kallisto和伪比对
STAR是reads比对器，而Kallisto是伪比对器（Bray等人，2016）。比对器和伪比对器之间的主要区别在于，比对器将reads映射到参考，而伪比对器将k-mers映射到参考。
3.6.1 什么是K-mer?
k-mers是从reads得到的长度为k的序列。例如，假设我们读取序列为ATCCCGGGTTAT，我们想从中制作7-mer。为此，我们将通过计算读数的前七个碱基找到第一个7-mer。移动一个碱基后，我们会找到第二个7-mer，然后计算接下来的七个碱基。图2显示了可以从我们的阅读中得到的所有7-mers：
3.6.2 为什么要比对k-mers而不是reads?
主要有两个原因：
- 伪比对器使用k-mers和计算技巧来比传统的比对器更快地进行伪比对。如果您对如何实现这一点感兴趣，请参阅（Bray et al。，2017）了解详情。
- 在某些情况下，伪比对器可能比传统的比对器更好地应对测序错误。例如，假设在上面的read的第一个碱基中存在测序错误，并且A实际上是T，将影响伪比对器比对第一个7-mers而不是剩下的7-mers。
3.6.3 Kallisto的伪模式
Kallisto有一个专门设计的模式，用于从单细胞RNA-seq实验中进行伪比对reads。与STAR不同，Kallisto与参考转录组而不是参考基因组比对。这意味着Kallisto将reads比对到剪接isoform而不是基因。由于以下原因，对单细胞RNA-seq，将read比对到isoform而不是基因是有挑战性的：
- 单细胞RNA-seq的覆盖率低于bulk RNA-seq，这意味着可以从读取中获得的信息总量减少。
- 许多单细胞RNA-seq方案具有3'覆盖偏向，这意味着如果两种isoform仅在它们的5'末端不同，则可能无法确定哪种isoform来自read。
- 一些单细胞RNA-seq protocol具有较短的reads长度，这也意味着不可能计算出来哪种isoform来自read。
Kallisto的伪模式采用略微不同的伪比对方法。Kallisto不是与isoform比对，而是与等价类（equivalence classes）比对。本质上，这意味着如果read比对到多个isoform，Kallisto将read记录为比对到一个包含所有此read比对到的isoform的等价类。不是在下游分析中使用基因或isoform表达估计，例如聚类，而是可以使用等价类计数。下图显示了一个有助于解释这一点的图表。
今天我们将只对一个细胞执行伪比对，但Kallisto还能够同时伪对齐多个细胞并使用来自UMI的信息。有关详细信息，请参阅https://pachterlab.github.io/kallisto/manual。
对于STAR，您需要在伪比对步骤之前为Kallisto生成索引。
任务6：使用以下命令生成Kallisto索引。使用Kallisto手册（https://pachterlab.github.io/kallisto/manual）找出此命令中的选项。
mkdir indices/Kallisto
kallisto index -i indices/Kallisto/transcripts.idx Share/2000_reference.transcripts.fa任务7：使用Kallisto手册确定用于执行伪比对的命令。你认为你知道答案，检查它是否与下一节中的解决方案匹配并执行伪比对。
3.6.4 Kallisto伪比对的解决方案
使用以下命令执行伪比对
mkdir results/Kallisto
kallisto pseudo -i indices/Kallisto/transcripts.idx -o results/Kallisto -b batch.txt 有关创建batch.txt的说明，请参阅https://pachterlab.github.io/kallisto/manual，如果遇到问题，请咨询教师。
3.6.5 了解Kallisto伪比对的输出
上面的命令应该产生4个文件 - matrix.cells，matrix.ec，matrix.tsv和run_info.json。
- matrix.cells包含一个细胞ID列表。由于我们只使用了一个细胞，因此该文件应该只包含“ERR522959”
- matrix.ec包含有关所用等价类的信息。每行中的第一个数字是等价类ID。第二个数字对应于该等价类中的转录本ID。例如，“10 1,2,3”意味着等价类10包含转录本ID 1,2和3。ID号对应于转录本在reference.transcripts.fa中出现的顺序。这里零索引被使用，意味着转录本ID 1,2和3对应于2000_reference.transcripts.fa中的第二，第三和第四转录本。
- matrix.tsv包含有关每个等价类的每个细胞比对中的reads数量的信息。第一个数字是等价类ID，如matrix.ec中所定义。第二个数字是细胞ID，其中细胞ID对应于细胞在matrix.cells文件中的顺序。第三个数字是属于该等价类的reads数量。例如，“5 1 3”表示3个reads从细胞1比对到等价类5。注意，这里用了零索引，因此单元格1对应于matrix.cells的第二行。
- run_info.json包含有关Kallisto如何执行的信息，可以忽略。