单细胞数据该怎么利用？

序言

什么情况下，我们会用尽全身力气来分析我们的10x单细胞转录组样本数据呢？最有可能的场合是，我们就靠这个毕业（哈哈哈哈….)。什么情况下，花了大量的时间和仅有的经费，一个10x数据的文章却只在Medicine上发表呢？（”我的课题只有一个10x样本肿么办？“）当然，我们也见识过不少只有一个10x数据发在CNS上，主要是方法学的研究和常见的大规模Landscape，Atlas之类的大样本文章。还有一类，那就是功能和测序结果紧密结合并且证明重要科学问题的文章。

文章信息

今天分享的文章发表在2019年9月的Nature Cell Biology上，来自两个Klein Labs，题目是“A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage”. 文章的重大科学意义在于解释了以牙齿为例的外胚层附属器发育和再生的干细胞异质性，文章的创新点在于十分严密的生物信息学和细胞生物学的结合。

文章背景

牙齿的形成是上皮-间充质相互作用的结果，最外层是体内最硬的矿化结构--“牙釉质‘。啮齿类动物的切牙有不断伸长的特点（这就是为什么老鼠喜欢磨牙），原因就在于根部（LaCL）有一群干细胞不断的快速增殖并且分化维持不断形成的牙釉质。而且，切牙从牙根向牙尖方向排列的细胞表现出细胞分化的不同状态，因此常作为体内分化模型在颅颌面发育再生领域被广泛研究。以往的研究（其实也是来自Klein Lab）发现位于外侧的细胞（OEE）是切牙干细胞的niche，但是这群干细胞本身是否存在”异质性“，而且这群细胞如何一步步分化维持牙釉质形成并没定论。

课题设计

这篇文章的亮点就在于并没有仅仅展示单细胞测序结果，而是一边进行单细胞测序分析一边进行大量的细胞生物学验证。主要包括两部分：

不同亚群的根尖上皮细胞

由于根尖上皮干细胞向成釉细胞分化是一个连续的过程，因此并没有形成界限明显的cluster，但是文章利用基于kNN的SPRING图分析发现根尖上皮存在三类细胞，其中第一类细胞为增殖活跃的一群细胞，在排除增殖效应后发现该类亚群也表达第二类不同细胞的标志。

同时利用Velocity，作者发现第一类细胞是第二第三类细胞的来源。

基于这个发现，作者直接利用H2B-GFP小鼠进行体内验证，显示位于IEE位置的高增殖活性的根尖上皮细胞其实才是以往被认为起源细胞（OEE）的来源细胞（下图中的绿色细胞逐渐向OEE方向迁移）：

而对于第二类细胞，作者利用每个cluster的标志基因鉴定了不同cluster在根尖上皮的分区定位：

损伤后再生成釉细胞的干细胞来源

切牙除了能够不断伸长外，在磨断情况下，切牙根尖上皮细胞仍然能够不断贡献成釉细胞分化和釉质形成。这部分，作者利用5-FU制造切牙损伤模型，并且在停药后再次分离根尖上皮细胞进行10x测序，并将其与正常生理条件下的根尖上皮细胞进行对比。

通过比对两种状态下10x数据，作者发现损伤后更多的根尖上皮细胞进入活跃的增殖状态并且绝大多数增殖形成的干细胞直接进入成釉细胞分化过程而较少的转化入OEE区。

总结

单细胞测序对于一部分学员而言，不仅仅是发表一个landscape类文章，更多的是为了找寻生物功能实验的新靶点解决一个具体的科学问题。这篇文章虽然只有较少量细胞的两个10x样本，但是生信分析始终指导着细胞生物学实验的方向，最终发现了”改变教科书“的结论。

同时，这篇论文并没有使用Seurat等以往论文介绍的分析软件，而是使用了SPRING可视化和FateID（介绍可参考如何去学一个R包（上） 和（下））进行拟时序分析。文章也在github上传了所有的绘图代码，感兴趣的学员可以尝试再现。