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阿兹海默症和小胶质细胞:人和小鼠脑细胞核转录组测序

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单细胞转录组分析综述

单细胞入门-读一篇scRNA-seq综述

文章信息

今天给大家分享一篇影响因子高达30的最新Nat Mde单细胞研究 。文章题目是:Human and mouse single-nucleus transcriptomics reveal TREM2-dependent and TREM2-independent cellular responses in Alzheimer’s diseas 。全文链接:https://sci-hub.tw/10.1038/s41591-019-0695-9

文章背景知识

阿兹海默症病人大脑中存在反应性的星形胶质细胞增多和小胶质细胞增生,同时有部分小胶质细胞出现激活(静息态的小胶质细胞一般呈现蛛网状,激活后的小胶质细胞呈现圆形),这部分激活的小胶质细胞文章中称为disease-associated microglia (DAM),也是本文章研究的核心。

这是我以前一篇文章中的图(IBA1染色),上面两张就是静息态的小胶质细胞,下面两张是激活的小胶质细胞,也就是DAM.

那什么是TREM2那? 首先小胶质细胞是髓系细胞,而TREM2是单次跨膜的超免疫球蛋白家族的一员,最早在髓系细胞衍生的树突细胞和小鼠巨噬细胞中发现,而以前的研究发现在AD的病人中存在的显著的TREM2基因变异,同时如果在小鼠中敲除TREM2的话,会发现小胶质细胞失去包裹Aβ的能力,同时大量转化为激活的形态-DAM,进一步导致神经炎症,增加AD的疾病进展。

样本处理

文章为了进一步研究TREM2和小胶质细胞关联性,选择了3种样本类型来进行单细胞测序:

  • N1:TREM2缺陷的小鼠
  • N2:TREM2基因变异的AD患者(TREM2-R62H和TREM2-R47H)
  • N3:人类对照样本

因为涉及到人类样本,很难取到新鲜的组织,所以作者采用了单细胞核转录组测序,这样不需要考虑细胞的活力,液氮冻存的组织也可以来用。

这里先给大家分享下文章中细胞核样本如何制备:

样本量:

  • 13例TREM2-CV变异的AD病人冰冻脑组织
  • 11例TREM2-R62H变异的AD病人冰冻脑组织
  • 12例对照
  1. 首先取冰冻脑组织在缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.4, 10mM NaCl, 3mM MgCl2, and 0.025% NP-40)中使用Dounce手动匀浆器
  1. 随后在冰上孵育15min,之后使用30um滤网滤掉碎片,随后把悬液在4度下500g离心5分钟
  2. 随后使用洗涤液(1%BSA in PBS with 0.2U μl–1 RNasin (Promega))将细胞核洗涤并过滤两次
  3. 再把核放入500ul洗涤液和900ul 1.8M蔗糖溶液中,在4度13000g离心45分钟,使核从髓鞘中分离出来,去除上清后,将核沉淀重新悬浮于洗涤液中,再用40um FlowMi 过滤即可
  4. 之后采用19X 平台进行单细胞转录组测序,10X官网也有完整的细胞核分离步骤,感兴趣的可以去检索。

数据分析

这篇文章也采用了Seurat package进行分析,过滤标准为:For quality control, nuclei with mitochondrial content >5% were removed. Nuclei that are duplets or multiplets were filtered out by two steps. First, nuclei with more than one marker gene expressed were removed. Then cells with high UMI and gene number per cell were filtered out. Cutoffs for UMI and gene number were determined on the basis of histograms showing cell density as a function of UMI per gene counts.最终保留了66,311 个细胞核。之后归一化标准化后使用top 20 PCAs进行了t-SNE分群

随后用FindClusters 功能找到每群细胞的marker基因,并且选出星形胶质细胞, 小胶质细胞和少突胶质细胞进行再次分群,以为观察相关亚型变化。

log2(fold change)>0.5, P <0.05作为差异基因筛选标准,当然差异基因筛选也是用的Seurat里的功能。

如果这里看不懂的话,你可能需要生信技能树的全网第二个单细胞视频课程预售 不吹不黑认真学了这个课程,上面这些你绝对可以自己分析加作图

总结

仔细的阅读了一遍文章,事实上,文章的内容并没有特别的地方,就是展示了,小胶质细胞以及星型胶质细胞在TREM2变异后的改变,同时通过免疫荧光染色和Nanostring进行了验证。

给大家分享几个文章中比较有用的点:

Point1:神经细胞核分类的marker基因,有做大脑的同学可以参考下

这个图也是Seurat包里面自带的,调整下颜色即可。

Point2:差异基因火山图注释,清晰明了一目了然在AD小鼠和正常之间那些基因出现差异

刚好已经有人教过大家怎么做火山图并注释基因了

在火山图上标记基因(方法三)

Point3:差异基因GO富集展示

这里就不得给大家推荐另一篇文章了

从基因名到GO注释一步到位

不得不提这篇文章的图片搭配非常好,放个figure大家看一下

单细胞---免疫荧光--流式 给人的感觉非常清晰~

Over~

本文分享自微信公众号 - 单细胞天地(sc-ngs),作者:Yiran

原文出处及转载信息见文内详细说明,如有侵权,请联系 yunjia_community@tencent.com 删除。

原始发表时间:2020-05-26

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