生物降解芳香族化合物的分子检测技术研究进展

摘要：

编码环羟基化加氧酶的基因常作为评价环境中微生物降解芳香族化合物能力的分子标记.

近年宏基因组学技术的出现极大地加速了对环境中功能基因及功能类群的研究.

本文总结了目前关于芳香族化合物环羟基化加氧酶基因的数据库,介绍了微生物降解芳香族化合物(苯系物、萘及其它多环芳烃)过程中发挥重要作用的各类功能基因,总结了环境检测中使用的分子引物,并综述了它们在各类复杂环境样本中的检测应用,此外对使用宏基因组技术来研究微生物在环境中降解芳香族化合物的能力进行了总结与展望.

关键词：

芳香化合物；微生物群落；功能基因；环羟化加氧酶；宏基因组

芳香族化合物因其具有对人体以及动植物危害极大的“三致”效应,其在环境中的迁移、转化受到了人们广泛的关注.生物降解是去除环境中芳香族化合物的最终途径,迄今为止已知大部分芳香族化合物的降解酶均存在于各类微生物(细菌、古菌及真菌)体内.利用微生物降解芳香族化合物安全高效、环境友好无二次污染,成为最有前途的治理环境污染的方法.微生物降解在污染物的迁移转化乃至最终消减的过程中占有重要地位,是环境中芳香化合物去除的最主要途径.

芳香族化合物的微生物降解主要包含5个重要过程:化合物被转运进入细胞;产生苯环裂解的前体;苯环裂解;转化为三羧酸循环的中间产物;中间产物进一步代谢分解.好氧代谢由于热力学上更有利发生而备受关注生活在土样表层和水体表层的细菌是主要的好氧降解者,而目前发现的大多数能以苯系物或多环芳烃 (PAHs) 为唯一碳源和能源的微生物及其功能基因也都集中在细菌的各个门之中另外,目前已经研究透彻的降解功能基因也主要集中于细菌的好氧降解过程.

环羟基化是芳香族化合物好氧降解的第一步及限速步骤,决定了微生物降解芳香化合物的能力,也是揭示微生物群落中各物种协同转化、同化、降解有机化学品的重要纽带.近年来随着分子检测技术的不断发展,针对芳香族化合物环羟基化过程功能基因的检测手段日渐多样,检测的通量和准确性都不断提高,并基于此设计了大量的特异性引物用于环境样本中降解菌群的检测.本文总结了目前已有的加氧酶数据库及已用于环境中功能基因和功能菌群检测的引物,综述了针对功能基因的众多分子生态学技术,并提出了未来的发展方向.

1 芳环羟基化加氧酶基因及分子生态学检测方法

1.1 芳环羟基化加氧酶的结构

芳环羟基化加氧酶(ARHOs)是芳环羟基化过程中发挥重要作用的功能酶,其催化的芳环羟基化过程是芳香化合物在环境中主要的降解矿化途径.

根据不同的加氧方式可以将ARHOs分为单加氧酶和双加氧酶.单加氧酶可在苯环上添加一个氧原子形成酚类化合物,同时另一个氧原子被还原为水.双加氧酶可在苯环上添加两个氧原子生成顺式二氢二醇化合物.

ARHOs属于多组分酶系统,一般由一个或两个可溶的电子传递蛋白(铁氧化还原蛋白和还原酶)和一个终端加氧酶组成.终端加氧酶可以是同聚物(αn)或者异聚物(αnβn),其中α是具有催化作用的大亚基,含有一个Rieske[2Fe-2S] 中心和单核铁,后者位于酶的催化中心.β是结构相关的小亚基,影响加氧酶最初构象,但有时也会缺失.α和β亚基共同影响底物特异性.

电子通过电子传递蛋白从NAD(P)H转移电子到终端加氧酶,被还原的终端加氧酶会反过来催化氧分子上的氧原子加到芳环上,这种区域和立体专一性的加氧是生物降解过程的限速步骤,它决定和控制后续的生物降解步骤的速率和潜力.

ARHO α亚基的氨基酸序列比其它组分具有更高的进化可塑性,及包含催化中心,是所有加氧酶都必需的重要组分,因而受到研究人员的青睐,常以α亚基作为标准构建不同物种中基因同源性关系及作为分子标记研究环境中存在的潜在功能基因及功能类群.

1.2 ARHOs的分类及相关数据库

自1990年根据其同源性差异首次对ARHOs进行分类之后,随着新的ARHOs不断发现,很多新的分类方法与类群被逐渐完善.

目前对ARHOs的分类主要是根据α亚基基因或氨基酸序列的同源性及其底物特异性.已有的关于ARHOs的分类学研究如表1所示.

虽然不同的分类方法略有差异,但这些酶都来自于纯培养的细菌,而可纯培养的细菌在环境总占比很少,仅不到细菌总数的1%,因此自然界中存在的加氧酶多样性要远高于我们的估计,宏基因组学研究也证实了这一点.

Chakraborty等在2012年根据进化关系、功能、底物结构及氧化位点对酶的分类进行了修正,从128株细菌中收集了165个ARHOs的α亚基,绝大多数来自变形菌和放线菌;另外通过全基因组数据又收集了132株细菌和7株古菌的246个ARHOs的α亚基同系物,发现除了以上两个门的细菌之外,还在蓝藻门、厚壁菌门、以及古菌的广古菌门等类群中发现了ARHOs.

根据系统发育关系,Chakraborty等重溯了加氧酶的进化历程.首先出现的是末端加氧酶组分,之后多种类型的电子转移蛋白出现,最后进一步演化为现存的多种加氧酶类型.

目前针对ARHOs的特异性数据库只有2个.

2009年Arora等发表了第一个加氧酶数据库OxDBase,涵盖当时已发现的具有生物降解有机物功能的加氧酶,共包含235个单、双加氧酶,并又进一步划分为芳环羟化酶和环裂解酶.该数据库建立时间早,但是更新缓慢,目前也只有240余个加氧酶数据.

第二个数据库为2014年Chakraborty等发表了针对生物降解和生物催化过程中的细菌ARHOs数据库RHObase,共计约1000个记录,包含196个加氧酶α亚基、153个加氧酶β亚基、92个铁氧化还原蛋白、110个还原酶及131个细菌种的318个加氧反应.对于每一个蛋白序列均可以搜索其结构和保守域,还能预测输入的序列是否属于加氧酶.除此之外,还有一些包含了ARHOs的基因或蛋白序列的综合性数据库如表2所示.

1.3 环境中基于芳香族加氧酶基因的分子检测技术手段

早期关于芳香族加氧酶的研究主要是在细菌纯培养体系中进行.虽然培养方法发现了一些重要的加氧酶基因,且很多至今还在广泛使用的引物都是根据纯培养菌株设计,但是培养方法效率较低,也无法反映自然状态下微生物总的降解潜力,而且实验室环境会改变微生物群落的初始结构,因此亟需更快速高效且稳定的方法提升对环境中加氧酶基因的研究.

随着分子检测技术的不断发展,非培养的分子生态学方法能够同时分析多个样本,并可重复、快速、有效地检测样本中的主要序列.克隆文库、荧光原位杂交、基于PCR产物的指纹技术如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)等方法逐渐出现并结合培养法应用于环境样本中基因片段的检测.

Kimura等根据8条序列比对设计了用于半巢式PCR的引物MGED-F11/CSYH-R10, FLNQ-F3,扩增86bp的产物.他们利用PCR-DGGE发现在表层森林土(10~15cm)加入氧芴或二噁英后芳环羟化双加氧酶(ARHD)基因的多样性更高.Bordenave等根据12个双加氧酶保守区设计引物FRT5A/FRT3B, FRT6A/FRT4B扩增nahAc型基因,利用克隆文库和T-RFLP发现了两个可能的新ARHD基因,同时发现长期慢性污染(30a暴露于炼油厂废弃物)显著改变了ARHDs的多样性.虽然分子手段的通量相较于培养已有了很大的提升,但是这些低通量的方法通常只会显示优势种类的片段,或只能分离一部分片段,无法对物种进行精确鉴定并严重低估了功能微生物的多样性.

宏基因组学的出现使得高通量检测微生物群落得以实现.高通量测序技术及基因芯片技术具有通量高、确定物种和功能准确全面,受污染干扰较小等优点,极大地促进了对环境中芳烃加氧酶基因的研究.

功能基因芯片(GeoChip)能够特异、灵敏、定量的分析微生物群落中的功能类群,最具代表性的GeoChip涵盖了6465个芳香化合物降解基因,包括388个联苯降解探针,167个苯甲酸盐降解探针和超过2400个针对单环芳香化合物和植物芳香族化合物的探针.目前Geochip已经更新到Geochip5,包含有关芳香化合物降解基因已超过一万个,是研究芳烃降解过程功能基因的强大工具.基因芯片已经应用于微宇宙、污染土壤、地下水和沉积物等多种类型的样本中.在微宇宙实验中利用GeoChip观察到了甲苯和萘杂交信号的一致性,表明了相关降解菌的动态变化.Leigh等利用GeoChip分析多氯联苯(PCBs)污染的土壤中细菌相应的功能基因.共检测到了27个基因,包括联苯、苯甲酸盐和其它双加氧酶亚基等.

稳定同位素探针(SIP)可以直接标记降解过程发挥作用的微生物及其基因组,消除了培养法的不足,是另一种在分子生态学中广泛使用的技术.可用13C标记降解菌的DNA,追踪发挥作用的功能基因.Martin等根据11个革兰氏阴性菌序列的保守区域设计引物Phn-RHDf2/Phn-RHDR3,该引物对简并度较高,主要针对Proteobacteria.另一对引物RHD-Beta-Grp1f/RHD-Beta-Grp1r简并度较低,主要针对 Betaproteobacteria.利用13C标记DNA并扩增特异的催化加氧基因序列,得到了2个较新的簇.Jeon等利用SIP技术研究萘污染场地原位代谢萘的细菌,首次从底泥中分离出一株新菌CJ2,其加氧酶基因之前只在环境样本中检测到.

定量PCR(qPCR)是一种快速、定量的方法,用来检测有相同功能的一类细菌.Nyyssonen等利用qPCR和GeoChip得到的功能基因拷贝数相关性很好,印证了两者都是评价生物降解效果很好的工具.Nyyssonen等根据15个参考序列设计了针对变形菌门多种萘降解基因引物的nahAF/nahARev.土壤泥浆微宇宙实验表明污染物的矿化和nahAc基因拷贝数存在较好的相关.另外基于qPCR的方法比基于杂交(dot blot)的定量方法更灵敏,两者得到的基因拷贝数差异可达一个数量级.Piskonen等也发现qPCR和杂交方法得出的拷贝数差异可达10倍.但是在Beller等的研究结果中两者却是一致的.Park等研究了石油污染土壤中萘降解过程nahAc基因的动态变化,qPCR检验萘降解速率和基因的拷贝数变化.在暴露于30×10-6萘蒸汽 6d后,nahAc基因拷贝数增加了1000倍.

从上世纪90年代开始陆续发现了很多加氧酶,并根据其核酸序列设计了特异性的引物用于研究环境中极高多样性的加氧酶基因.目前已设计的一些环羟化加氧酶基因引物如表3所示.

目前多数的研究都表明,在多种污染条件和不同环境类型中,功能基因丰度与污染物浓度或降解速率之间都存在显著的正相关关系.

Yergeau等利用GeoChip和qRT-PCR研究了引物PAH-RHDα GN F/PAH-RHDα GN R检测的降解菌群落,发现功能基因丰度和萘矿化速度显著相关.Wu等首次研究了珠江口沉积物(0~10cm)中PAH-RHD基因多样性和分布.冗余分析表明NH4-N, NO3-N, ∑PAHs, pH值, SiO3-Si与革兰氏阴性菌的加氧酶功能基因 (PAH-RHD[GN])正相关,而PO4-P,水深与 PAH- RHD[GN]负相关.Xia等利用半巢式PCR考察了长江中游沉积物、悬浮沉积物及上覆水(表层沉积物1m以上)群落中萘、菲降解菌携带的nahAc和nidA基因的多样性,发现PAH-RHD[GN]基因多样性及nahAc和nidA基因拷贝数存在沉积物>悬浮沉积物>上覆水的规律,且nahAc和nidA基因拷贝数和环境因子无显著相关,但与萘、菲生物可利用量的多少显著相关.Lozada等研究菲、苯并(a)蒽、苯并(a)芘等不同水平PAHs污染的近海海岸沉积物(0~3cm),发现ARHD基因型数量和PAHs含量存在强相关关系(r=0.834, P<0.05).Tuomi等发现微宇宙实验中,好氧污染样本nahAc基因和萘矿化速度、微生物总量、呼吸速率、有机物含量相关(r2=0.34-0.47, P<0.01).Dionisi等发现煤焦油污染的淡水沉积物中萘的浓度和nagAc型基因拷贝数相关(nagAc- DNA/ug, r=0.89;nagAc-干重沉积物/g, r=0.77).Wu等利用qPCR发现引物PAH-RHDα GP F/PAH-RHDα GP R扩增得到的农业土壤样本革兰氏阳性菌中的PAH-RHDα和PAHs含量显著相关(r=0.409),而与土壤pH值, TC, TN, TP, NH4+, NO3-等无相关性.众多研究中的相关性再次印证了RHDα可作为良好的分子标记应用于污染环境中功能基因和功能类群多样性的研究.

2 针对不同芳香族化合物的分子检测应用

2.1 苯系物

苯系物,即芳香族有机化合物(MACHs),是指苯、甲苯、乙苯、二甲苯、三甲苯、苯乙烯、苯酚、苯胺、氯苯、硝基苯等苯及其衍生物,因其具有高挥发性和高毒性而成为污染物降解领域的热点.

而目前对于苯系物的微生物降解功能基因的研究主要集中于苯、甲苯、乙苯、二甲苯、联苯等物质.Hendrickx 等根据苯系物降解基因tmoA, xylM, todC1, tbmD的片段设计了不同的引物,并检测了苯系物污染不同地点、深度土壤细菌群落和基因多样性的分布.苯系物污染地区中检测到的优势菌为Actinobacteria和Proteobacteria,功能基因中tmoA是最主要的降解基因.tmoA在污染、非污染地区都有检出,而xylm只在污染地区发现.tmoA型基因在不同的α-Proteobacteria如Agrobacterium、Sphingomonas以及革兰氏阳性菌Arthrobacter中检出,xylM型基因在Sphingomonas和Rhodococcus中检出.tmoA和xylM基因片段在系统发育关系很远的菌株中出现证明了2个苯系物代谢基因之间的水平转移现象.随后,Hendrickx等通过中宇宙实验用相同引物检测降解菌群的原位动态变化也得到了相似的结论.

另外,萘和苯系物降解基因的相关性在多个研究中都得到了证明.Iwai等根据联苯双加氧酶基因设计引物BPHD-f3/BPHD-r1,并应用于PCB污染土壤,成功扩增出萘双加氧酶基因和一些新的双加氧酶基因,验证该引物的覆盖度较广.Baldwin等利用不到10个参考序列分别设计了针对萘、联苯、甲苯、二甲苯双加氧酶及苯酚单加氧酶的多对引物BPH1-F/BPH1-R,BPH2-F/BPH2-R,BPH3-F、BPH4-F/BPH3-R,TOD-F/TOD-R,产物长度从206~757bp不等.qPCR结果表明在苯、甲苯、乙苯、二甲苯污染的环境样本中检测到的萘双加氧酶基因拷贝数和污染浓度呈正相关关系.

利用植物、动物等生物修复技术治理苯系物污染是环境修复领域的研究热点.de Carcer等利用引物bphA668-3/bphAr1153-2 进一步考察了多氯联苯污染土壤在用柳树进行植物根际修复后细菌群落及联苯双加氧酶基因的变化.PCR-TGGE和测序结果表明污染土壤和根际土中细菌群落及其代谢水平都存在显著的差异.非根际土和根际土分别构建了48、47个克隆子的克隆文库,且非根际土克隆文库多样性高于根际土.根际富集了降解PCBs过程中发挥重要作用的Proteobacteria和革兰氏阴性菌的降解基因,柳树对PCBs降解菌产生了正向的作用.

此外,Li等利用植物修复PCBs污染的土壤发现植物显著提高了土壤中PCB降解菌的数量及其对PCB的移除效率, bphA, bphD等基因数量在植物存在时显著提高.Luepromchai等根据8条序列比对设计引物A13-gc/A1r.考察土壤中加入蚯蚓后PCB降解菌Ralstoniaeutrophus和Rhodococcus sp. ACS功能基因的变化.结果表明蚯蚓加入后增加了PCBs降解菌的数量和bphA基因数量,提升了生物降解速率.

2.2 萘及其它多环芳烃

萘的降解一直是过去几十年关注和研究的重点,是研究多环芳烃生物降解的模式化合物.而萘双加氧酶具有多种酶的活性,不仅可以催化萘和具有类似结构的芳香族化合物如菲、蒽、甲基萘、二苯并噻吩等双加氧;还可以催化多种芳香烃或苯环结构化合物的单加氧过程.

研究萘双加氧酶基因对认识分解代谢质粒的行为、细菌遗传信息的水平转移、加氧酶基因和酶的进化提供了新的见解;提高了有效管理、处理污染环境以及为新技术开发新型酶的能力.

1964年第一次报道了来自Pseudomonassp.的萘降解途径.Pseudomonas sp.在多种污染环境中都存在且在污染后得到富集,在快速降解污染物阶段也是优势物种.迄今为止大多数分离的萘降解菌仍属于Pseudomonas,其催化组分称之为萘1,2-双加氧酶(NDO),具有α3β3的亚基结构.其中α亚基具有催化作用,基因在不同细菌中高度保守,通常被用于分子标记.

基因的水平转移使得很多物种携带了NDO基因.许多革兰氏阴性菌如Pseudomonas, Burkholderia, Comamonas及革兰氏阳性菌如Mycobacteria, Rhodococcus已发现具有萘双加氧酶系统.很多特异性的引物也被设计用于扩增特定降解菌中的功能基因.

Wang等在含盐土壤中以菲为唯一碳源富集得到一株嗜盐的菲降解菌CY-1,属于Marinobacter,通过引物PAH-RHD-396F/ PAH-RHD-696R 发现其加氧酶基因类似于nah型基因,是由nah相关基因簇通过水平基因转移进化而来的新型基因簇hpah,并发生了耐盐性进化.通过RT-PCR进一步证明了hpah的表达.该研究首次克隆并表达了耐盐的nah型的双加氧酶基因.Marcos等采集PAHs慢性污染的亚南极海洋沉积物建立克隆文库.利用20株海洋细菌Nocardioides, Mycobacterium, Rhodococcus比对保守区域设计了针对革兰氏阳性菌的引物NMR331f/NMR1134r,发现了14种不同的基因片段,大多与Nocardioides, Mycobacterium, Rhodococcus, Terrabacter,Bacillus这几个属的双加氧酶相关,但是氨基酸水平上的相似性较低(33%~62%),证明了极端环境中加氧酶基因的高可变性.极端环境十分脆弱,易受到污染,低温也会减弱污染物的降解速率,一旦受到污染难以消除,对于极端环境中污染物的消解与功能基因的类群还需要继续深入研究.

红树林是热带和亚热带沿海独特的潮间带湿地,受到人为污染非常严重.Gomes等研究了暴露于不同PAHs污染的红树林沉积物中ndo基因多样性.根据21条参考序列设计了引物NAPH-1F/NAPH-1R, NAPH-2F/NAPH- 2R.巢式PCR-DGGE和Southern 印迹杂交都证明ndo基因的分布具有地点特异性.在红树林生态系统中ndo和nag型基因丰度很高,没有检测到nahAc.该结果表明ndo基因相较于广泛研究的nahAc和phnAc可能在红树林生态系统萘降解过程中发挥重要作用.

由于PAHs可溶性低且迁移率低,地理位置对降解基因的多样性及丰度影响极大.

Lozada等采集潮间带沉积物(0~3cm)样本并建立克隆文库.发现样本中不同基因簇的数量和PAHs的种类高度相关.Yagi等使用引物Rieske_f/Rieske_r发现nah和nag基因共存于煤焦油污染的含水层群落中,而不同时间地点特异性的地化性质导致了不同基因丰度变化很大,煤焦油附近淡水沉积物中nagAc型基因丰度可以作为萘污染的指示基因.Ding等发现菲降解过程中ARHD基因的丰度、多样性及系统发育关系是由土壤类型决定的,但是其多样性和丰度如何被不同的土壤类型影响在很大程度上仍属未知.虽然ARHD具有地点特异性的属性,但相隔很远的ARHD基因之间也存在一致性.

Parnell 等的研究发现基因的水平转移使得功能基因的相似性要高于基于16S rRNA得到的物种分类上的相似性.对phnAc的系统进化分析表明phnAc发生了基因水平转移,几乎完全一样的基因出现在了系统发育距离很远的菌株中.另外在南美洲和南极洲、亚洲和欧洲发现了一些共有的微生物及相同的等位基因,表明了扩散效应(风、洋流、宿主)使得基因发生了大范围的扩散.

随着鉴定出的降解菌属及基因多样性越来越高,革兰氏阴性和阳性菌中的PAH-RHDα出现了较为明显的区分,研究者可以在此基础上设计覆盖度更高的引物.

Ding等根据40个革兰氏阳性和阴性菌的多种PAHs的羟化酶大亚基基因(PAH- RHDα) 设计了引物pah-rhdα-396F/pah-rhdα- 696R,产物320bp,新引物可以覆盖革兰氏阴性菌的nahAc, phnAc, nagAc, bphA1,ndo-3, ndo-5及革兰氏阳性菌的phdAc, narAa, nidA等其它RHDα基因.利用新引物考察了2种不同类型土壤(淋溶土和始成土)加入菲后功能基因的丰度和多样性.qPCR表明加入菲63d后,PAH-RHDα基因在淋溶土中比始成土高一个数量级.表明了土壤类型控制着土壤细菌类型,进一步控制着PAH-RHDα基因的数量.

Cebron等根据20个革兰氏阴性降解菌的功能基因片段和15个革兰氏阳性降解菌的功能基因片段分别设计了新的引物PAH-RHDα GN F/PAH-RHDα GN R及PAH- RHDα GP F/PAH-RHDα GP R,产物片段分别为306bp和292bp, qPCR结果表明PAH-ARHD基因拷贝数/16S基因拷贝数和PAHs污染浓度呈正相关关系(R2=0.82).PAHs降解菌最多可以在PAHs污染地区占到细菌群落的1%.克隆文库结果表明nidA3型基因簇被优先检测出来,可能存在两种解释:第一,对于环境样本,PAH-RHDα GP优先扩增nidA3型基因;第二,这类基因表达量大.nidA3型基因已被发现和菲,芘,苯并[a]芘等高分子量PAHs降解相关.其它研究发现石油污染的土壤中nahAc基因表达量不到细菌总量的0.01%,高速公路人行道旁边土壤中nidA型基因表达量不到细菌总量的0.003%.

3 结论与展望

人类活动使得芳香族化合物在环境中不断累积,为了应对环境中多种芳香化合物,ARHOs进化出可催化多种高取代芳烃和多环芳烃等有毒化合物的广泛的底物特异性.

由于微生物对芳烃化合物代谢能力具有多样性,利用微生物对环境污染进行生物修复、进而解决环境问题引起了广泛的关注,而利用保守引物检测降解芳香族化合物的微生物总量对了解环境污染修复有着重要的现实意义,同时理解降解基因的多样性还可以为揭示微生物物种在功能、生态和进化上的关系提供更多的科学依据.

而要实现准确定量降解微生物的总量和了解功能基因的多样性,在方法学上需要满足以下几个条件.

3.1 不断更新数据库

数据库的建立是重中之重,培养得到新的芳烃降解菌是非常重要的基础性技术工作.组学和测序技术日新月异的发展极大的促进了ARHO序列的发现,目前对于信息的收集整合、分析还较为滞后.已发表的数据库中的参考序列受到局限并更新缓慢,亟需开发更全面、功能更强大的数据库并不断更新,为我们提供技术支持.

近年来随着宏基因组技术的兴起,对原核生物的纯培养逐渐被忽视,但纯培养对于阐明这些微生物的功能是必需的;近年来得到了迅猛发展的培养组学可综合利用多重培养条件,并辅助以16s rRNA测序及基质辅助激光解吸电离离子源和飞行时间质量分析器(MALDI–TOF)技术,让更多微生物得以培养.传统的纯培养技术得到的加氧酶种类还比较单一,今后的重点应放在继续优化培养条件筛选新颖的降解菌和降解基因,如寻找极端环境中的加氧酶基因,或者代谢多氯代、多硝基、稠环、杂环芳香类化合物等复杂化合物的加氧酶基因,并不断丰富现有数据库.

研究污染物的代谢过程及功能基因的多样性是环境及微生物生态领域的重要课题.鉴定和表征新的ARHOs不仅帮助理解ARHOs的分类学分布和进化关系,还可对其催化机理、结构和代谢多样性有更深入的认识.

此外数据库的质控同样重要.采用更准确的基因组注释、比对、聚类、分析等算法能得到更高质量的数据信息,在此基础上研究芳烃加氧酶基因才能更好的发掘功能基因之间的内在联系.

3.2 谨慎选择和设计引物

从环境样本中直接扩增降解菌相关的功能基因,引物设计和选择非常重要.目前现存的很多引物覆盖度不够,且对于引物的使用仍没有统一的标准,各个研究之间对于同一对引物的结果还存在较大的争议.因此在不断丰富的数据库基础上,引物的设计与选择可以综合考虑以下几点进行:

首先确定所研究的加氧酶基因类型.对于扩增革兰氏阴性或阳性的加氧酶基因,或者验证新的物种或基因是否包含Rieske中心需采用不同的特异性引物.

其次需要广泛收集候选的引物,所有的引物都考虑作为前端或后端引物的候选,全面系统的评价引物覆盖度、特异性、产物长度等指标,并且可以同时使用多对引物研究环境样本中的RHDα的多样性.引物覆盖度取决于引物的保守性、简并性、及PCR条件(引物、模板错配),而特异性和覆盖度是矛盾存在的,更高的简并性往往得到更高的覆盖度,但是特异性会相对较低,就会得到更多的非目标序列,因此需要在两者之间进行权衡.若一端引物使用了简并,那么另一端可以选择低简并性的引物来增加特异性.

另外,不同样本加氧酶基因组分不同,因此需要测试多种退火温度决定引物的特异性.此外,不同引物扩增得到的产物长度不同.产物越长对基因的鉴定越准确,但同时也越容易在扩增的时候产生误差.由于高通量测序仪对片段长度有所限制,更需要对扩增长度谨慎考虑.

另外引物不仅需要计算模拟,还需要在环境样本中进一步测试,仅通过软件预测还会带来一些偏差.

最后,扩增条件也需要优化,合理的设定PCR循环条件如退火温度也能提升产物的质量.

3.3 不断开发新的技术方法

RHOs在多种细菌的质粒和染色体上都可能存在,其表达受到多种环境因子的调控.现有的分子级测序技术虽然极大地促进了RHOs多样性的研究,但同时也存在一些缺陷.

DGGE、TGGE、克隆文库等分子检测技术通量及准确性较低,而新兴的技术如SIP不能对生物降解过程的效率提供直接的信息;GeoChip不能得到相关基因的数量和活性,以及有多少基因参与到代谢过程.虽然绝大多数利用qPCR的研究都发现了污染物与功能基因之间良好的相关性,但也在一些研究中观察到无相关性的结果.因此需要开发更快、更直接的方法,并结合现在已有的分子技术对功能基因的多样性、表达情况、与污染物浓度及降解活性之间的关系进行深入、定量的探索.

3.4 对微生物的降解酶和功能基因进行更深入的研究

目前绝大多数的RHOs来源于细菌,但在少量的古菌及植物 (RHO_alpha_C_CMO-like保守域) 中也发现了RHO的同源性基因,它们的作用目前还不为人知.因此对于古菌、植物中存在的功能基因还需进行深入研究.

现阶段研究的重点也都集中在好氧过程,而在厌氧条件下芳香族化合物的降解和好氧氧化机制完全不同.不同的芳香族化合物在苯环裂解之前会先经过多种修饰化作用,如脱羟基、脱氨基、脱卤、脱甲氧基、脱烷基等,转化为两种重要的中间体:苯甲酸和4-羟基苯甲酸.而其中发挥关键作用的苯甲酰CoA还原酶和4-羟基苯甲酰CoA还原酶的工作机制还未完全阐明,且还未被设计为引物用于环境样本的研究.

此外,生物降解芳香族化合物的一个重要挑战是跟踪微生物对环境变化的响应.功能基因受限于不同的时间、地点、事件,但也会随着扩散和水平基因转移等作用扩大其分布的范围.后续的研究也应聚焦于环境改变引起功能基因长期的变化,进而带来的功能基因及功能类群反作用于环境而引发的长期环境影响.

综上,目前对微生物的降解功能还有很多未知,为了使用ARHOs基因作为分子标记来检测各类环境中微生物的芳烃降解潜力,需要完善已知降解酶和相关基因的数据库,综合考虑引物设计的覆盖性和特异性,开发新的分子生态学方法,并且深入研究相关功能微生物中的降解酶和功能基因.

随着研究的深入,越来越多的微生物功能类群会得以认识,为利用微生物群落降解环境污染物提供更多的科学依据.

完