MycoKeys：不同分析平台带来的ITS测序结果的差异

Link:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6160831/?report=classic

Journal: MycoKeys

IF: 2.435

Published: 2018 Sep 11

First author: Sten Anslan

Corresponding author: Sten Anslan, Mohammad Bahram

Department: Braunschweig University of Technology (德国布劳恩斯威格理工大学)

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比较了不同分析平台在两组高通量测序数据集上的性能。结果表明，计算时间、质量控制以及输出结果在很大程度上取决于所使用的平台。

PipeCraft、LotuS和PIPITS在真菌扩增子数据集的性能优于QIIME2和Galaxy，但是没有一个平台能够很好地过滤错误。

结论为每个平台的输出都需要通过分类学信息对OTUs进行手动验证。

两套数据

Illumina MiSeq ITS2，节肢动物基质

Pacific Biosciences (PacBio) Sequel，土壤样本

考察了5个平台

PipeCraft: Flexible open-source toolkit for bioinformatics analysis of custom high-throughput amplicon sequencing data.[Mol Ecol Resour. 2017]

PIPITS: an automated pipeline for analyses of fungal internal transcribed spacer sequences from the Illumina sequencing platform.[Methods Ecol Evol. 2015]

LotuS: an efficient and user-friendly OTU processing pipeline.[Microbiome. 2014]

QIIME2: QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.[Nat Methods. 2010]

Galaxy: The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.[Nucleic Acids Res. 2016]

另外还提到了一个平台：

SEED 2: a user-friendly platform for amplicon high-throughput sequencing data analyses.[Bioinformatics.2018]

质控方法

VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics.[PeerJ. 2016]

Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.[Bioinformatics. 2014]

DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.[Nat Methods. 2016]

sdm:属于LotuS

fastx (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit)

PipeCraft, LotuS, PIPITS中有ITSx去掉非真菌序列。

去嵌合体及生成OTU

VSEARCH or USEARCH

采用de-novo single linkage clustering的方法。前文报道过reference-based clustering methods得到的结果与之类似：

Moving beyond de novo clustering in fungal community ecology.[New Phytol. 2017]

a. Illumina;

b PacBio.

去掉singletons

数字为剩余的reads数

NA: indicate not available; NP: not performed.

得到OTU之后，进行了多次进一步的筛选。

先用BLAST比对，去掉不是真菌的物种。

再根据e-value和覆盖度筛选，e-value高于1e-25且覆盖度低于70%的序列也被删除。

每个样本中小于10个reads的OTU也被去掉

之后利用LULU再筛选一次。

此外，还将各自平台质控后的数据pool到了一起，再次得到一个单独的OTU。

对于Illumina,用CD-HIT 97%相似度聚类。

CD-HIT: accelerated for clustering the next-generation sequencing data.[Bioinformatics. 2012]

对于PacBio, 用UPARSE 97%聚类。

数据分析

OTU进行Hellinger转化后进行PERMANOVA。

NMDS去除异常点。

稀释曲线用RTK做

结果

不同平台稀释曲线差异很大。两个数据集内部不同方法都存在显著差异。

a.不同平台得到的每个样本的OTU;

b，再次基础上又经过多步筛选后的每个样本的OTU。数量显著下降，不同平台之间更加趋近。也表明任何平台都不能有效的减少错误的OTU。

作者推荐Illumina数据用PipeCraft, PIPITS or LotuS；

对于PacBio数据，推荐PipeCraft。